FERMENTACION EN ESTADO SÓLIDO. TEMAS 1. Introducción A 2. Escala de laboratorio D 3. Escalas piloto e industrial A 4. SSF con aireación forzada R 5. SSF.

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1 FERMENTACION EN ESTADO SÓLIDO

2 TEMAS 1. Introducción A 2. Escala de laboratorio D 3. Escalas piloto e industrial A 4. SSF con aireación forzada R 5. SSF sin aireación forzada D 6. SSF mezclado continuo R 7. SSF intermitente A

3 FERMENTACION EN ESTADO SÓLIDO (SSF) “Es un proceso microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles” Viniegra-González (1997)

4 INTRODUCCION Pan egipcio, proteína comestible japonesa Objetivos: Aumentar el contenido proteico alimentos, mejorar su conservación, cambiar sus características físicas, el color, el olor o el sabor de los mismos. Ejemplos: Koji (Aspergillus oryzae sobre cereales cocidos) Queso Roquefort (Penicillium roqueforti en leche de oveja) Shoyu, Miso y Ontjom Necesidades: Polución de suelos Uso potencial de biorremediación Alternativas de alimentos para animales

5 CARACTERISTICAS Contenido bajo de agua Fase de gas entre las partículas Baja conductividad eléctrica (aire vs. agua) Gran cantidad de matrices (Composición, tamaño, resistencia mecánica, porosidad Hongos (Crecimiento apical, actividades enzimáticas)

6 VENTAJAS Medios de cultivo simples (Subproductos agrícolas con alto contenido de nutrientes) Baja actividad del agua (Evita contaminación de bacterias y levaduras) Reactores más pequeños (Concentración del sustrato mayor al igual que la productividad volumétrica) Aireación forzada facilitada por la porosidad del soporte (Alta transferencia de O2) Conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos (menores costos y manipulaciones en el inóculo) Tecnología limpia Calidad de enzimas superior Glucosidasa (Calor) Fitasa (Estabilidad en peletización) Proteasa (Digestión de proteínas)

7 DESVENTAJAS La transferencia de oxigeno puede ser limitante según el diseño del reactor Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad Temperatura y humedad del medio Morfología de los microorganismos (en especial de los hongos) debido a su resistencia a la agitación Esterilidad Escalado (Generación de calor y heterogeneidad) Extracción del calor metabólico a gran escala sin control Medición de pH, T, contenido de humedad y concentraciones Procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión. Diseño de reactores y el escalado poco caracterizados. Tiempo de fermentación mayor (microorganismos con bajas velocidades específicas de crecimiento)

8 PROCESO SSF

9 APLICACIONES Abono orgánico Ensilado Maduración de quesos Cultivo de champiñones

10 INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Humedad y actividad del agua (a w ). Porcentaje de humedad entre 30 y 80%, según el sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del proceso (formación de producto, crecimiento de la biomasa). Actividad del agua (a w ): Caracteriza las interacciones agua- medio sólido. a w : Humedad relativa de la atmósfera gaseosa en equilibrio con el sustrato. Ejerce influencia sobre el crecimiento, la formación de productos y el crecimiento celular.

11 INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES pH Afecta el desarrollo de los procesos SSF Imposible de controlar, debido a la ausencia de instrumentos capaces de medir el pH en la capa de líquido que rodea el sólido. El pH cambia por diferentes razones: Disminuye por la secreción de ácidos orgánicos (acético y láctico) durante el proceso. La fuente de nitrógeno utilizada influye mucho en la tendencia que sigue el pH Investigaciones para formular medios de cultivo que permitan mantener, de manera natural, el pH en un intervalo deseado durante el proceso. Raimbault y Alazard (1980): Crecimiento de Aspergillus niger en harina de yuca y una mezcla de sulfato de amonio - urea de 3 a 2 (calculado en base al nitrógeno) para mantener el pH en el intervalo de 5 a 6.2 (favorable para el crecimiento del microorganismo).

12 INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Temperatura Ejerce una acción determinante en el conjunto de actividades celulares (crecimiento y la formación de productos) Control crítico por la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y la baja conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido - líquido - gas, lo que favorece la acumulación del calor metabólico en el sistema y el aumento de la temperatura del cultivo que favorece tres aspectos negativos: La actividad microbiana se desacelera o se detiene. Se deshidrata el medio sólido. El metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la deshidratación. Intercambio de calor por convección forzada con elevadas tasas de aireación que con frecuencia deshidratan al medio. Utilización del calor latente de vaporización del agua para eliminar el calor metabólico de manera rápida y efectiva.

13 INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Concentración y disponibilidad del sustrato Nutrientes necesarios balanceados para favorecer el crecimiento del microorganismo, la eficiencia de conversión energética y la respiración. Conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado Conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto, y los valores de la energía de mantenimiento para establecer los requerimientos de las fuentes de carbono.

14 INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Aireación Microorganismos aerobios Suministrar oxígeno, extraer CO2 formado y calor metabólico evolucionado Flujo óptimo de aire debe considerar: Naturaleza del microorganismo Requerimientos de oxígeno para el crecimiento y/o la formación del producto deseado Velocidad de generación de calor metabólico Concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles Espesor de la masa de sólido La aireación en SSF es fácil porque la superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las partículas

15 INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES El inóculo Tipo de inóculo Micelio: Mejor competitividad del hongo, reducción de posibles colonizaciones del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización más rápida del hongo debido por los bajos tiempos de incubación Esporas: Reducción de los costos en la etapa de propagación del microorganismo.

16 »TIPOS DE REACTORES«

17 ESCALA LABORATORIO Los primeros reactores en estado sólido eran cajas de Petri y Erlenmeyers. Un equipo de ORSTOM diseñó el modelo de columnas para estudios en SSF. ♦ Reactor usado en escala de laboratorio patentado por ORSTOM.

18 NUEVA GENERACIÓN Control computarizado Muestreo sin contaminación Permite elaborar perfiles de crecimiento vs. Variables asociadas 1- Tapa 2- Termómetro en el medio 3- Cilindro de acero 4- Termómetro para aire de ingreso 5- Medidor de humedad 6- Resistencia calefactora 7- Medidor de temperatura en agua 8- Medidor de flujo 9- Medidor de nivel 10- Aislante

19 REACTORES SSF CON MEZCLADO REACTOR DE TAMBOR ROTATORIO Mejora la transferencia de masa y calor Permite la homogenización de las variables Puede generar inconvenientes asociados a aglomeración 1- Entrada de aire 2- Junta rotatoria 3- Acople 4- Toberas de aire 5- Línea de aire 6- Rodillos 7- Tambor rotatorio 8- Medio sólido 9- Llantas

20 REACTOR DE TAMBOR PERFORADO Incrementa la distribución de oxígeno Puede generarse taponamiento por el medio sólido y el microorganismo

21 MEZCLADOR DE PALAS Posee el mezclado más eficiente 1- Entrada de aire 2- Termocuplas 3- Chaqueta 4- Palas 5- Salida de aire 6- Motor 7- Reactor 8- Medio sólido 9- Eje de agitación

22 BIOREACTOR ZYMOTIS LAB Usado en fermentaciones estáticas Alta transferencia de calor Pueden haber inconvenientes para la transferencia de Oxígeno

23 ESCALAS PILOTO E INDUSTRIAL Poca diversidad Transferencia de calor Acanalamientos de aire Hinchamiento del medio Resistencia mecánica de microorganismos a la agitación Requerimientos de oxigeno Rango de temperatura Métodos apropiados de inoculación Necesidad del pretratamiento del sustrato Esterilidad Facilidad de llenado, vaciado y limpieza del reactor

24 ESCALAS PILOTO E INDUSTRIAL Clasificación: Aire circulando alrededor del sustrato Aire circulando a través del sustrato Sin mezclado Intermitentes Camas mezcladas continuas

25 BIOREACTORES SSF CON AIREACIÓN FORZADA Se introduce aire a través de un tamiz, que soporta al sustrato. Es un reactor simple que puede procesar unos pocos kilogramos de medio sólido seco. Herramienta para: Analizar empíricamente la evolución global de un proceso y determinar parámetros como temperatura y humedad relativa del medio. Estudiar la difusión del oxígeno y los fenómenos de transferencia de masa y calor.

26 Son muy útiles en ausencia de modelos matemáticos para el escalado. No tienen agitación mecánica. Agitación manual. Están limitados por la producción metabólica de calor. Inevitables gradientes de T. (1)

27 La mayoría del calor es eliminado por convección y por la evaporación del agua que hay en el medio. Por lo cual se debe adicionar agua de manera uniforme. (1)

28 BIOREACTOR ZYMOTIS Es una torre con platos perforados en los cuales se coloca el medio sólido. Aire estéril pasa a través de cada plato. Debajo de cada plato hay un intercambiador de calor. (1)

29 BIOREACTOR ZYMOTIS Los platos son esterilizados previamente con aire seco o con vapor. Cada plato funciona como una enorme caja de petri. Los platos son incubados en amplios cuartos, que tienen un filtro de aire (0.2 μm o menor). Hay una dispersión de agua sobre los cuartos para mantener la atmósfera saturada.

30 PLAFRACTOR Diseñado por Biocon (compañía India) El aire que entra y sale del sistema es filtrado para retirar microorganismos. El reactor esta sellado, de manera que está libre de contaminantes externo. Remoción de calor por medios conductivos. Como el aire es mal conductor se usa agua como fluido de enfriamiento.

31 Canales de cultivo: Fluidos para esterilización Ajuste de humedad y O 2. Extracción de sustancia de interés después del cultivo. (1)

32 Canales sin cultivo: Fluidos de enfriamiento o calentamiento. Dentro de cada módulo tiene un brazo de mezcla que gira alrededor del eje central del módulo. Se usa principalmente para producción de metabolitos.

33 La matriz que soporta los nutrientes se esteriliza y enfría dentro del reactor. El inóculo es adicionado y mezclado de forma aséptica después de que el medio se ha esterilizado.

34 BIOREACTORES SSF SIN AIREACIÓN FORZADA Es la más sencilla y practicada desde siglos atrás. El micro organismo puede ser transferido al reactor como un molde insertado en el medio de cultivo. Corresponde a la mayoría de sistemas de fermentación en bandejas, aplicados en fermentación de quesos. Requiere grandes áreas para el proceso. Es difícil mantener aséptico el proceso

35 REACTOR KOJI 1- Caja Koji 2- Válvula de agua 3- Lámpara UV 4-8-13- Sopladores de aire 5- 11- Filtros de aire 6- Salida de aire 7- Humidificador 9- Calentador 10- Recirculación de aire 12- Entrada de aire 14- Bandejas 15- Soportes

36 REACTOR DE MEZCLA CONTINUA CON AIREACIÓN. Es un tambor rotatorio que sirve para maximizar la exposición de cada partícula con el aire circulado. Se usa en laboratorio y en escala pre-piloto. Micelio y partículas de sustrato pueden aglomerarse impidiendo una buena transferencia de masa, calor y oxígeno. Incrementar la velocidad de rotación del tambor, afecta el crecimiento del micelio debido a efectos cortante.

37 TAMBOR ROTATORIO DISCONTINUO Opera igual que el anterior. Entre una agitación y la otra actúa como un reactor de platos.

38 Hay diseños en los cuales hay un control de temperatura (termocoupla en el medio) con el cual se aumenta o se disminuye la rotación del tambor de acuerdo al aumento o disminución de la T.

39 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Lechos empacados con aire acondicionado fluyendo a través de ellos. Agitación periódica Rocío de agua cuando se requiera Alto rango de capacidades (Kg – Ton) según esterilidad

40 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA PROCESOS NO ESTÉRILES Koji rotatorio automático Usado en Asia para la fabricación de salsas de soya Control computacional de T y flujo de aire y agitación Inoculación ex-situ Rectangular con circulación de aire a través del medio con agitación periódica Simple y básico

41 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Koji rotatorio automático

42 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Grupo INRA en Dijon (Francia) T y humedad del medio reguladas con T, humedad relativa y flujo de aire Rocío de agua y agitación periódica Mediciones on-line de la masa de medio Estimación automática de la perdida de masa debido a la respiración Bomba de inoculación y agua de suministro. Software especializado para el control del acondicionamiento del aire Modelo matemático para mantener la humedad del medio Pasterización in-situ Facilidad de escalado

43 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA PROCESOS ESTÉRILES Pequeños sin aplicación industrial publicada Necesarios por: Legislación en algunas industrias Altos tiempos de cultivo por bajas velocidades de crecimiento de los microorganismos utilizados Wageningen University (Holland ) Escala piloto Para biopesticida Sustrato de granos de cereales húmedos Recipiente cónicomezclado con una cinta en la pared Esterilizable in-situ con vapor Sensores de temperatura a lo largo del lecho

44 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Durand Planetary mixing device Manejado con un micro- computador Fed-Batch Produccion de conidios para control biologico No existen escalados

45 SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Durand

46 DIFERENCIAS ENTRE REACTORES SSF

47 REFERENCIAS 1.Durand A., Bioreactor designs for solid state fermentation, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 113–125 2.Pandey Ashok, Solid-state fermentation, Biotechnology Division, Regional Research Laboratory, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 81–84 3.Raghavarao K.S.M.S, Ranganathan T.V, Karanth N.G, Some engineering aspects of solid-state fermentation, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 127–135 4.Suryanarayan Shrikumar, Current industrial practice in solid state fermentations for secondary metabolite production: the Biocon India experience, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 189–195