1 Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad.

Presentación del tema: "1 Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad."— Transcripción de la presentación:

1 1 Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 3 de mayo de 2013

2 2 Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

3 3 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS tandem MS Espectrometría de masa

4 4 1- Generalidades Espectrometría de masa

5 5 Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos Espectrometría de masa

6 6 Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

7 7 Espectrometría de masa Determinación de masa y/o composición:  Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares  Polisacáridos, oligosacáridos  Lípidos  Lipidoma  Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar  g-ng (y menos) de material Espectrometría de masa de Biomoléculas

8 8 Espectrometría de masa  Determinación de masa y/o composición  Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos  Modificaciones postraduccionales  Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM  Plegamiento  Niveles de expresión/modificación posttraduccional Espectrometría de masa de Proteínas

9 9 Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

10 10 Espectrometría de masa cyt C ~ 12000 Da

11 11 Espectrometría de masa Espectrometría de masa biológica Lisozima

12 12 Los Iones son importantes Espectrometría de masa [M+Na] +, [M+K] +, [M+NH 4 ] +, [M+Cl] - De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M+H] + o [M-H] - De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H] 2+, [M+nH] n+ ) En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M] *+, [M] *- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

13 13 Espectrometría de masa PM (péptido) = 1162 Da Modo positivoModo negativo m = +1 +23 +39

14 14 Espectrómetro de masa Espectrometría de masaEntrada:Volatilización/Ionización AltoVacío Analizador de masas Detector Muestra MALDI ESI TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector Magnético

15 15 ¿Cómo volatilizar una proteína? Espectrometría de masa Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

16 16 Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) Espectrometría de masa MALDI-TOF: MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS FT-MS: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

17 17 2- MALDI-TOF Espectrometría de masa

18 18 Ionización por MALDI: Espectrometría de masa (Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H +. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

19 19 MALDI-TOF Espectrometría de masa Matriz

20 20 MALDI Espectrometría de masa Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz

21 21 MALDI-TOF Espectrometría de masa Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z) 1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

22 22 MALDI-TOF Espectrometría de masa Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: E k = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma E k, ½mv 2 = zeEs  v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D  m/z = 2eEs(t/D) 2

23 23 MALDI-TOF Espectrometría de masa ½mv 2 = zeEs  v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D  m/z = 2eEs(t/D) 2 Fuente Sin E, iones a la deriva Detector Fig. Separación por TOF ++ + E + - s D +

24 24 Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Espectrometría de masa Carlos Cerveñansky

25 25 Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Espectrometría de masa Carlos Cerveñansky

26 26 MALDI-TOF Espectrometría de masa

27 27 MALDI-TOF Espectrometría de masa Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF

28 28 MALDI-TOF Espectrometría de masa

29 29 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) 1672.92 Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Resolución en MALDI-TOF Carlos Cerveñansky

30 30 Los Isótopos son importantes Espectrometría de masa Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu), se basa en una escala relativa al 12 6 C = 12 amu  1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10 -24 g Abundancia isotópica: 12 C12.000098.90 % 13 C13.00341.10 %

31 31 ElementoMasa% 1H1H1.007899.985 2H2H2.01410.015 12 C12.000098.90 13 C13.00341.10 14 N14.003199.634 15 N15.00010.366 16 O15.994999.762 17 O16.99910.038 18 O17.99920.200 31 P30.9738100.00 32 S31.972195.02 33 S32.97150.75 34 S33.96794.21 36 S35.96710.02 79 Br78.918350.69 81 Br80.916349.31 Carlos Cerveñansky

32 32 Carlos Cerveñansky

33 33 100 572557295733573757415745 Mass (m/z) 0 2093 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % Intensity Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] 2xC 13 C 12 C 13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1  l de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM) Carlos Cerveñansky

34 34 MALDI-TOF Espectrometría de masa

35 35 3- ESI-MS Espectrometría de masa

36 36 ESI-Q Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization - Quadrupole Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N 2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo

37 37 Espectrometría de masa ESI N2N2

38 38 ESI Espectrometría de masa

39 39 ESI-Q Espectrometría de masa Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

40 40 ESI-Q Espectrometría de masa

41 41 ESI-Q Espectrometría de masa

42 42 ESI-Q Espectrometría de masa

43 43 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+

44 44 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris) 10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+

45 45 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro x 1 = (M+n)/n x 2 = (M+n+1)/(n+1)  n = (x 2 -1)/(x 1 -x 2 ) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328 n+n+ (n+1) +

46 46 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo

47 47 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM Alto PM

48 48 ESI-MS Espectrometría de masa

49 49 Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

50 50 Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ionPocas, en general 1Muchas Rango de m/z500003000 Rango de masas200.00070.000 Interacciones no covalentes NoSi MS/MSlimitado, PSDSi, CID Acoplar LCNoSi Tolerancia a contaminantes SiNo

51 51