1 Introducción a la espectroscopía vibracional 1..Conceptos básicos  Estados vibracionales y energía  Modos normales de vibración  frecuencia de vibraciones.

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1 1 Introducción a la espectroscopía vibracional 1..Conceptos básicos  Estados vibracionales y energía  Modos normales de vibración  frecuencia de vibraciones 2..Técnicas  Espectroscopía infrarroja  Regiones del IR  Grupos funcionales  "Huellas digitales"  Número de ondas e intensidad  Reglas de selección  FTIR y sus ventajas  Espectroscopía Raman  Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes)  Reglas de selección  Ventajas sobre el IR  Resonanacia Raman 3..Aplicaciones a proteínas  Análisis de estructura secundaria  Cálculos  Asignaciones  Uso de isótopos  Grupos laterales

2 2 Bibliografía  Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984)  Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984).  Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180  Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290  Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

3 3 Introducción a la espectroscopía vibracional Espectro electromagnético Frecuencia (Hz) Longitud de ondaTipo de radiaciónTipos de transición 10 20 - 10 24 10 -12 - 10 -16 mRayos gammaNuclear 10 17 - 10 20 1 nm - 1 pmRayos XElectrones internos 10 15 - 10 17 400 - 1 nmUltravioletaElectrones externos 4.3x10 14 - 7.5x10 14 700 - 400 nmVisibleElectrones externos 10 12 -10 14 2.5 µm - 700 nmInfrarrojoVibraciones 10 8 - 10 12 1 mm - 2.5 µmMicroondasRotaciones 10 0 - 10 8 10 8 - 1 mRadiofrecuenciaInversión de spin

4 4 Estados vibracionales y energía Frecuencia de la vibración k = constante de fuerza del enlaceF = -kx µ = masa reducida, para un sistema diatómico

5 5 cm -1 IRRAMAN estiramiento (sim) 1340-+ estiramiento (asim) 2349+- deformación667+- deformación667+- Modos normales de vibración (3N - 5) O O CO O C O O CO O C

6 6 Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección: No todas las vibraciones serán “activas” en IR Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración

7 7 INFRARROJO

8 8 N-H C-H C=O INFRARROJO

9 9 FTIR Espectrometría IR con Transformada de Fourier 1.Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador. 2.Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez 3.Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm -1 4.Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral

10 10 CN C HC O estiramiento NH (3236 F)amida I (1653 F) amida II (1567 F)amida III (1299 M) amida IV (627 D)amida V (725 F) estiramiento NC (1096 D) estiramiento CN y CC (881 D) deformación CCN (436 D) deformación CNC (289 D) amida VI (600 M) amida VII (206 M) Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida)

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12 12  antiparalela hélice  transición  ovillo estadístico Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967) 242, 5460-5466 Estructura secundaria

13 13 Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957 Estructura  Estructura  Estructura secundaria

14 14 Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y FTIR Proteína% Hélice% Cadena extendida FTIRRXFTIRRX Carboxipeptidasa40393330 α-Quimotripsina12105049 Concanavalina A4260 Lisozima41452119 Papaína27293229 Ribonucleasa A21225046

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16 16 1H2O1H2O 2H2O2H2O Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777 Uso de isótopos

17 17 BIAP (A)apo BIAP (B)Asignación tentativa 1682 C=O amida I (hoja  ) 1660 C=O amida I (giro) 1651–16521652 C=O amida I (hélice  ) 1633 C=O amida I (hoja  ) 1586–15771586–1571 C=O COO – Asp o Glu 1547  N-H amida II 1516–1517 OH anillo Tyr 14431455  N- 2 H amida II y 2 HOH Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2 H 2 O, pH 6.6 Uso de isótopos

18 18 Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2 H 2 O a 25º C, pD = 3.1 Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974) 1 = 27 min 2 = 63 min 3 = 180 min 4 = 21 h Uso de isótopos

19 19 FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus. Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867. Isótopos y posición de las bandas

20 20 Unión de ligandos

21 21 Sir Chandrasekhara Venkata Raman, ( சந்திரசேகர வெங்கடராமன் ) Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888 Bangalore, Karnataka - 21/11/1970 Premio Nobel de Física 1930 Técnicas: Raman Dispersión inelástica de fotones estados electrónicos virtuales

22 22 muestra Láser, luz monocromática Monocromador, espectrógrafo Regla de selección: Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula. Ventajas de Raman con respecto a IR 1.Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho más sensibles 2.El agua produce una dispersión Raman muy débil 3.La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad 10 2 - 10 4 veces mayor

23 23 N N

24 24

25 25

26 26 Resonancia Raman estado electrónico excitado estado electrónico basal estado energético virtual Raman Resonancia Raman La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo

27 27 Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem 254(3): 662-70 = 406.7 nm

28 28 Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338 [hemo] = 0.34 mM [SO 4 2- ] = 400 mM SO 4 2-

29 29 Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus = 476 nm Uso de isótopos

30 30 Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).

31 31 Infrarrojo y Raman El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia) Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor

32 32 Introducción a la espectroscopía vibracional 1..Conceptos básicos  Estados vibracionales y energía  Modos normales de vibración  frecuencia de vibraciones 2..Técnicas  Espectroscopía infrarroja  Regiones del IR  Grupos funcionales  "Huellas digitales"  Número de ondas e intensidad  Reglas de selección  FTIR y sus ventajas  Espectroscopía Raman  Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes)  Reglas de selección  Ventajas sobre el IR  Resonanacia Raman 3..Aplicaciones a proteínas  Análisis de estructura secundaria  Cálculos  Asignaciones  Uso de isótopos  Grupos laterales