UAP Filial AQP – FMH y CS - F y B: Microbiología Farmacéutica

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1 UAP Filial AQP – FMH y CS - F y B: Microbiología Farmacéutica
: MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA Guerrero Benavides, Mariella Isabel Clase No. 3 Fecha: Hora: Salón:

2 BOSQUEJO DE NOTAS DE CLASES
BACTERIOLOGIA FAMILIA MICROCOCCACEAE CARACTERISTICAS GENERALES, CULTURALES Y METABOLICAS. ESTRUCTURA Y PRODUCCION DE SUSTANCIAS. MICROORGANISMOS DE INTERÈS.

3 Familia Micrococcaceae

4 Familia Micrococcaceae Género Micrococcus:
Caracterìsticas Generales: Los micrococos son cèlulas esféricas dispuestas en masas irregulares, racimos, tétradas o paquetes. La mayor parte de las especies que predominan en los alimentos son Gram + positivas. Su temperatura óptima de crecimiento está entre los 25 y los 30 ºC, creciendo bien en los medios de cultivos ordinarios. Pero algunos micrococos crecen bien a temperaturas alrededor de 10 ºC o incluso más bajas. Los micrococos son muy abundantes en la naturaleza, viéndose aislado mas frecuentemente del polvo y del agua. A menudo se encuentra en utensilios y equipos usados en alimentaciòn que no han sido adecuadamente limpiados e higienizados.

5 Familia Micrococcaceae Género Micrococcus:
Caracterìsticas Generales (cont): Ciertas especies son capaces de utilizar las sales amónicas y otros compuestos nitrogenados simples como única fuente de nitrógeno. La mayoría de las especies fermentan los azúcares, produciendo cantidades moderadas de ácido. Algunos son àcidos proteolíticos (M. freudenreichii). Otros toleran gran cantidad de sal, creciendo por lo tanto a niveles de humedad bajo; estas especies se desarrollan en salmueras de curado de carnes, tanques de salmuera, etc. Muchos son termodúricos, es decir, resisten la pasteurización comercial de la leche (M. varians). Otros son pigmentados y dan una coloración anormal a las superficies de los alimentos sobre los que crecen; M. luteus, por ejemplo, es amarillo y M. roseus, rosa.

6 Familia Micrococcaceae Género Staphylococcus
Caracterìsticas Generales Los estafilococos Gram + positivos. Pueden crecer aislados, en parejas, en tétradas o en masas irregularmente agrupadas como racimos de uvas. Especie mas importante: Staphylococcus aureus , generalmente crece con un color amarillo, aunque en ocasiones puede ser blanco. Necesita una fuente nitrogenada orgánica y en sus necesidades de oxígeno es facultativo. Es beta-hemolítico, coagulasa positivas. Son patógenas y algunas producen una enterotoxina que causa intoxicaciones alimentarias.

7 Características Bioquímicas de los Micrococos y Estafilococos
Aislamiento: La muestra patològica se siembra en placas de agar sangre o en agar sangre hidratado de cloral para impedir la difusión de proteus y se siembra en caldo de carne salado. Se incuba durante la noche a 37 ºC. El crecimiento del caldo su siembra al dìa siguiente en placas de agar sangre.

8 Características Bioquímicas de los Micrococos y Estafilococos
Bùsqueda en productos alimenticios: Se preparan suspensiones al 10% en agua peptonada al 0,1 % en un Stomacher Lab Blender. Si se sospecha choque térmico, se añaden cantidades de 0,1 ml a varios tubos que contengan 10 ml de caldo BHI (infusión de cerebro corazòn). Se incuba durante 3 – 4 horas y seguidamente se resiembra. Se utilizan uno o mas de los medios siguientes: agar leche salino (MSA), agar fosfato de fenolftaleína polimixina (PPP), medio de Baird – Parker (BP) o agar yema de huevo telurito polimixina (TPEY). Se incuban durante 24 – 48 horas. Se ensaya con amoniaco en el medio PPP investigando colonias fosfatasa positivas.

9 Micrococos y Estafilococos
Identificación: Las colonias de estafilococos y micrococos en medios ordinarios son pardo doradas, blancas, amarillas o rosas, opacas, cupuladas, de 1 – 3 mm de diámetro tras 24 horas en agar sangre y por lo general se emulsionan fácilmente. Pueden ser b - hemolítica en agar sangre.

10 MEDIOS DE CULTIVO PARA ESTAFILOCOCOS

11 Agar Manitol Salado (Chapman)
Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 10.0 Extracto de carne 1.0 d-Manitol 10.0 Cloruro de sodio 75.0 Agar 15.0 Rojo de fenol pH final: Instrucciones Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a C durante 15 minutos.

12 Agar Manitol Salado (Chapman)
Entre los medios específicos para su recuperación tenemos el medio de Chapman, que posee manitol y una alta concentración de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus, proporciona un pH ácido al medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo rosado (el del medio de Chapman).

13 Agar Manitol Salado: Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o púrpura.Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles,posteriormente,la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

14 Agar Manitol Salado: Fundamento
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal,y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura

15 Agar Manitol Salado:Resultados
Staphylococcus aureus Fermentacion del Manitol (+) Staphylococcus epidermidis Fermentacion del manitol (-) Staphylococcus saprofiticus Fermentacion del manitol (+)

16 Agar Manitol Salado:Resultados
Microorganismos Crecimiento Características de las colonias Staphylococcus aureus ATCC Excelente Amarilla Staphylococcus epidermidis ATCC Bueno Roja Escherichia coli ATCC Inhibido Inhibido Klebsiella pneumoniae ATCC Inhibido Inhibido

17 En medio de Baird – Parker
Emulsión de yema de huevo-telurito Composición: Emulsión de huevo 50 g Telurito potásicyema de o 3,5 por 100 Sulfametazina 0,2 por 100 Agua destilada mL Triptona 10 g Extracto de carne 5 g Extracto de levadura 1 g Piruvato sódico 10 g Glicina 12 g Cloruro de litio 5 g Agar 20 g Agua destilada mL Disolver por calentamiento y agitación. Ajustar el pH a 6,9 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos. Enfriar a 50 ºC y añadir 50 de emulsión estéril yema de huevo-telurito. Mezclar uniformemente y preparar placas de Petri.

18 En medio de Baird – Parker
En medio de Baird – Parker después de 24 horas, Staphylococcus aureus forma colonias negras, brillantes, convexas, de 1 – 1,5 mm de diámetro; hay un estrecho borde blanco y las colonias están rodeadas por una zona clara de 2 – 5 mm de diámetro. Este aclaramiento puede hacerse evidente tan solo a las 36 horas. El medio de Baird-Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros gérmenes Gram positivos, , El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estafilococos.

19 Prueba de la coagulasa:
Reacción en tubo: Se añaden 0,2 ml de plasma a 0,8 ml de caldo nutritivo (sin glucosa) en un tubo pequeño. Se siembra con el estafilococo sospechoso y se incuba a 37 ºC en un baño maría durante 6 horas. Se examina a la hora y luego a cada media hora. Deben incluirse en la prueba controles conocidos positivos y negativos. S. aureus puede formar un coágulo, gelificar todo el contenido del tubo o producir una trama floja de fibrina. Reacciòn en portaobjeto: La acciòn de la enzima coagulasa que coagula el plasma es del S. Aureus. Hay dos vías de realizar esta reacción: Se emulsionan una o dos colonias en una gota de agua sobre un portaobjetos. Si no se forman grumos en 10 – 20 segundos se coloca 2 gotas de plasma humano o de conejo (EDTA) y se agita la suspensión bacteriana con S. aureus aglutina en 10 segundos, formando grumos visibles. Siempre se debe tener una cepa de coagulasa positivo como contraprueba.

20 Reacción DNAsa: Se siembran placas de agar DNAsa con un asa de manera que el crecimiento en las placas sea como de 1 cm de diámetro. Se incuba durante la noche a 37 ºC. Se inunda la placa con ácido clorhídrico 1N. La transparencia alrededor de las colonias indica actividad de DNAsa. El ácido clorhídrico reacciona con el ácido desoxirribonucleico no alterado para dar un precipitado turbio.

21 Prueba de catalasa Bacterias que viven en ambientes aerobios requieren de catalasa para convertir el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular. Es positiva la prueba cuando se ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con H2O2 al 3% y se producen burbujas de oxígeno. Se emplea para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positivo) del género Streptococcus (catalasa negativo).  

22 Prueba de catalasa distinguir Staphylococcus de Streptococcus

23 Aureasa: Beta galactosidasa:
Aureasa: Es específica de Staphylococcus aureus y se manifiesta mediante una fluorescencia visible bajo luz ultravioleta. Beta galactosidasa: Es un enzima que también permite la diferenciación entre las dos especies coagulasa negativas más frecuentes (S. epidermidis negativo y S. saprophyticus positivo).

24 Reacción de la fosfatasa
Se siembra agar fosfato fenolftaleína y se incuba durante la noche. Se expone a los vapores de amoníaco. Las colonias de estafilococos coagulasa positivos viran a rosa. S. aureus produce una reacción positiva (aunque se han señalado cepas negativas). Los estafilococos y micrococos coagulasa – negativos son por lo general fosfatasa negativos.

25 Otras reacciones Reacción de Evans y Kloos
Se preparan cultivos agitados en medios de tioglicolato de Brewer que contengan 0,3 % de agar. Se incuban a 37 ºC y se examina el crecimiento sumergido, es decir, el crecimiento anaerobio (estafilococos) o el superficial (micrococos). Reacción de Schleifer y Kloos Se emplea agar púrpura base comercial que contenga 10 nl de glicerina y 0,4 mg de eritromicina/litro. Los estafilococos varía el color del indicador (púrpura de bromocresol) amarillo: los micrococos no crecen.

26 Reacción de la lisostafina:
Se prepara una solución de lisostafina (Sigma Chemicals) disolviendo 10 mg en 40 ml de tampón fosfatos (0,02 M). Se ajusta a pH 7,4 y se añade NaCl para obtener una concentración de 1 % (p/v). Se distribuye en cantidades de 1 ml y se conserva a –60 ºC. Para usarlo se añade 1 ml a 9 ml de tampón fosfatos y se mezclan cinco gotas de un cultivo en caldo incubado durante la noche en un tubo de ensayo pequeño. Se incuba a 35 ºC y se examina si se ha producido lisis a los 30, 60 y 120 minutos. Debe incluirse un testigo utilizando tampón fosfatos en vez de Lisostafina. Se lisan la mayoría de los estafilococos.

27 Reacción de la lisostafina:
Lisostafina: La lisostafina es un enzima que rompe la pared de Staphylococcus y no tiene acción sobre Micrococcus / Kocuria; por esta razón se utiliza para diferenciar estos géneros. En presencia de lisostafina, una suspensión (turbia) de estafilococos acabará lisándose, y por lo tanto perderá esa turbidez inicial. La lisostafina, al no ejercer ningún efecto sobre Micrococcus / Kocuria; mantendrá la misma turbidez que originalmente tenía la suspensión. Otras pruebas que nos pueden ayudar a diferenciar con precisión entre ambos géneros se muestran en la siguiente tabla:

28 Otras pruebas de Diferenciaciòn

29 MICROORGANISMOS DE INTERÈS Staphylococcus aureus:
Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocáceas de 0,8-1,0 mm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Son grampositivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes. Más del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, forúnculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulación.

30 Staphylococcus aureus:
Además algunas cepas de S.aureus son patógenas para el hombre porque producen enterotoxinas que dan lugar a la intoxicación estafilocócica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 106 ufc/g para producir cantidad suficiente de enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor.

31 MICROORGANISMOS DE INTERÈS Staphylococcus aureus:
Esta especie es coagulasa y DNAsa positiva, produce ácido e la lactosa, maltosa y manitol, reduce los nitratos, hidroliza la urea y reduce el azul de metileno. Es por lo general fosfatasa positivo, aunque no crece en agar fosfato de amonio. La mayoría de las cepas son hemolíticas en agar sangre de caballo, pero la zona de hemólisis es relativamente pequeña si se compara con el diámetro de la colonia (diferenciación con los estreptococos hemolíticos).

32 MICROORGANISMOS DE INTERÈS Staphylococcus aureus:
La producción de pigmento amarillo dorado es probablemente la característica mas variable. Los cultivos jóvenes pueden no producir ningún pigmento. Puede desarrollarse color si se dejan los cultivos uno o dos días sobre la mesa del laboratorio a temperatura ambiente.

33 MICROORGANISMOS DE INTERÈS Staphylococcus aureus:
Se favorece la producción de pigmento pr la presencia en el medio de lactosa o de otro carbohidrato y de sus productos de escisión. La mejor forma de demostrarlo es en agar glicerina monoacetato. En los laboratorios clínicos, se identifica generalmente S. Aureus bien por la reacción de la coagulasa o la de la DNAsa.

34 Staphylococcus aureus:
La fermentación del manitol no es fiable. Se hallan cepas de S. Epidermidis que fermentan el manitol. S. aureus es un agente corriente de las infecciones piógenas y de las toxiinfecciones alimentarias. Los estafilococos se diseminan por las actividades domesticas y comunitarias tales como hacer cama, vestirse o desvestirse. Se hallan presentes fosas nasales, sobre la piel y el cabello de una gran proporción de la poblaciòn.

35 Staphylococcus aureus:
Las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina con frecuencia dan resultados negativos en la prueba para coagulasa sobre portaobjetos, lo que sugiere que una misma estructura celular contribuye a la expresión del factor de agregación y a la resistencia a la meticilina.

36 DIFERENCIACIÒN

37 Enfermedades y toxinas

38 Susceptibilidad antimicrobiana de Staphylococcus aureus

39 Susceptibilidad antimicrobiana de los estafilococos

40 BIBLIOGRAFIA PELZAR, MICHAEL. Microbiologìa Editorial Mc Graw – Hill. 2ª edición. Impreso en Mèxico, S.A. SCOTT, BAILEY. Diagnòstico Microbiológico. Editorial Panamericana. 7ª edición. Impreso en Argentina. CARPENTER PHILIP. Microbiología. Editorial Interamericana. 2ª edición. Impreso en Mèxico. COLLINS, C.H. Métodos Microbiológicos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza España. Impreso en España. MADIGAN, MICHAEL. Biologìa de los Microorganismos. Editorial Prentice may. 8ª edición. Impreso en España (1999).