Industria Química Enzimas Enzimas para la industria Química

Presentación del tema: "Industria Química Enzimas Enzimas para la industria Química"— Transcripción de la presentación:

1 Industria Química Enzimas Enzimas para la industria Química
LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES EN LA INDUSTRIA QUÍMICA Industria Química Enzimas Enzimas para la industria Química MODIFICACIÓN Y MEJORA DE SUS PROPIEDADES BIOTECNOLOGÍA E INGENIERIA ENZIMÁTICA MEJORA DE ENZIMAS PARA AUMENTAR SUS POSIBILIDADES DE UTILIZACIÓN EN PROCESOS INDUSTRIALES

2 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
Enzima soluble Enzima inmovilizada Soporte + E Re-uso o uso continuo Control de la reacción más sencillo Proceso más limpio INMOVILIZACIÓN MEJORAR LAS PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS

3 VENTAJAS USO ENZIMAS INMOVILIZADAS
Mejor control de la reacción y del reactor Re-uso del derivado durante varios ciclos Posibilidad de aumentar la concentración de la enzima en la reacción No contaminación del producto por la enzima Estabilización??? COSTE PROCESO DE INMOVILIZACION + SOPORTE

4 chemical modification
INACTIVATION OF ENZYMES pH 7.0, 4ºC dissociation conformational changes aggregation heat pH hydrophobic interfaces hydrolysis by proteases chemical modification

5 IMMOBILIZATION OF ENZYMES: EFFECTS ON OPERATIONAL STABILITY
no real ?? rigidification 3D No aggregation No proteolysis No interaction with interfaces porous supports FNR stabilization by pure immobilization pH7, no stirring pH7, stirring pH5, no stirring pH7, biphasic system with stirring experimetal condition stabilization 1 10000 2500 1000

6 Sustratos insolubles Sustratos muy grandes
LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES SOLUBLES Reuso ? Proteolisis Agregación Interacción con interfase Sustratos insolubles Sustratos muy grandes

7 S P S S S S S S S REACTORES DE ULTRAFILTRACION
La enzima soluble puede reusarse Todos los mecanismos de inactivación son posibles S S S S

8 INACTIVACION DE ENZIMAS POR SUPERFICIES HIDROFOBICAS

9 INFLUENCE OF THE HYDROPHILIC SHELL ON DAO INACTIVATION COURSES IN THE PRESENCE OF HYDROPHOBIC INTERFACES UNDER STRONG AGITATION. S P P S P S S P S P S S P S P P : soluble DAO (0.04 IU/mL). : DAO-dextran (20000 Mw) conjugate (0.04 IU/mL) : Control without agitation P

10 : soluble Trypsin (0.5 IU/mL).
INFLUENCE OF THE HYDROPHILIC SHELL ON TRYPSIN INACTIVATION COURSES IN THE PRESENCE OF HYDROPHOBIC INTERFACES : soluble Trypsin (0.5 IU/mL). : Trypsin-dextran (20000 Mw) conjugate (0.5 IU/mL) : Control without agitation. The experiment was carried out at 4ºC in n-heptane saturated buffer under strong agitation

11 INFLUENCE OF THE HYDROPHILIC SHELL ON TRYPSIN INACTIVATION COURSE
: Trypsin-dextran (20000 Mw) conjugate (0.04 IU/mL) : Control without agitation.

12 Todo el sólido es proteína No hay gasto de soporte
DERIVADOS SIN SOPORTE Todo el sólido es proteína No hay gasto de soporte Estabilización operacional Rigidificación ? Microambiente ?

13 POSIBILIDADES CLECs Enzimas puras y cristalinas
Crosslinked Enzyme Crystals Crosslinked Enzyme Aggregates CLECs Enzimas puras y cristalinas Necesidad de enzima pura Estabilizacion de proteinas multimericas CLEAs Enzimas con trazas de impurezas Coagregacion de enzimas Agregacion de enzima y polimero Estabilizacion de enzimas

14 Propiedades mecánicas independientes de la enzima
INMOVILIZACION DE ENZIMAS SOBRE SOPORTES PREEXISTENTES Propiedades mecánicas independientes de la enzima Posibilidad de unión covalente multipuntual Sustratos grandes Gasto soporte Residuos despues de la inactivación

15 INMOVILIZACION POR ADSORCION
Protocolos de inmovilzación sencillos El soporte puede regenerarse cuando la enzima se inactiva Reducción de residuos Riesgo de liberación de la enzima al medio de reacción Estabilización??

16 Sistema ideal para la inmovilización reversible de enzimas
Adsopción fuerte y no distorsionante Adsorción en soportes recubiertos de Polímerosiónicos polifuncionales??? Muchos grupos en el soportes La proteína puede “embeberse” en la cama Inmovilización multipuntual El polímero se adapta a la enzima En vez de forzar a la enzima a adaptarse al soporte

17 + Enzyme + Polyethyleneimine

18 DESORPTION OF INVERTASE FROM ANIONIC
EXCHANGER SUPPORTS + pH 7, 25ºC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + PEI-support DEAE-support

19 anionic exchangers at growing ionic strength
Desorption of IMAC/b-galactosidase of Thermus sp strain T2 from different anionic exchangers at growing ionic strength Desorbed activity, (%) [NaCl], (mM)  Activity released from DEAE (after 30 min of being adsorbed)  Activity released from PEI Experimental conditions: pH 7, 25ºC

20 Thermal stability of IMAC/b-galactosidase of PEI derivatives
from Thermus sp strain T2  Soluble enzyme  PEI derivative Residual activity, (%) Time (h) Experimental conditions : pH 7, 70ºC

21 REUSE OF THE PEI-COATED SUPPORT
+ + + + + + + + + ENZYME INACTIVATION + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + WASHING AT 10 mM HCl AT 40ºC WASHSING IN 9 M GUANIDINE OR UREA AT 40ºC IMMOBILIZATION OF FRESH ENZYME NEW ACTIVE BIOCATALYST

22 INMOVILIZACION SOBRE ANTICUERPOS
Inmovilización / purificación en una etapa Orientación de la proteína Unión reversible Estabilización

23 V V DOMINOS POR INMOVILIZACION Gen + dominio gen Proteina nativa
Proteina con el dominio V V Soporte con dominio de actividad Inmovilizacion soluble Inmovilizacion reversible

24 Útil cuando la enzima requiere ser estabilizada
UNION COVALENTE Posibilidad de estabilización por unión multipuntual La unión de la enzima al soporte es muy fuerte Tras inactivación hay que eliminar el soporte y la enzima Útil cuando la enzima requiere ser estabilizada previa a su utilización

25 Very slow intermolecular covalent immobilization
IMMOBILIZATION ON EPOXY SUPPORTS H2N Very slow intermolecular covalent immobilization HS HO pH 7.0, 4-25 °C Mild physical adsorption plus H2N very fast intramolecular covalent binding

26 IMMOBILIZATION AT LOW-IONIC STRENGTH
IMMOBILIZATION AT HIGH-IONIC STRENGTH

27 Sub-optimal immobilization rates
NH3+ H2N “rapid” Covalent attachment Slow physical adsorption NH3+ NH3+ O HN NH3+ O HN “slow” Covalent attachment NH3+ NH3+ H2N Rapid Physical adsorption Sub-optimal immobilization rates

28 “Rapid covalent attachment”
NH2+ NH2+ H2N - H2N - “Rapid adsorption” of the protein “ High density of Amine groups” “ High density of Epoxy groups” NH2+ N2H NH - NH2+ NH - Intense Multipoint covalent attachment?? “Rapid covalent attachment”

29 ESTABILIZACION POR INMOVILIZACIÓN PURA
No hay agregación No hay interacción con interfases No hay posibilidad de proteolisis Las burbujas de gas o gotas de disolvente no pueden penetrar en los poros Las moléculas de enzima estan dispersas

30 SOLIDOS NO POROSOS La superficie especifica depende del tamaño de la partícula Tamaños muy pequeños no pueden manejarse No protege de interfases o proteolisis Utiles para todo tipo de sustratos Partículas magnéticas magneto

31 Modificación propiedades Vidrio de poro controlado
SOL-GELES Polimerización y “curado” UV, Tª Estabilización Modificación propiedades Vidrio de poro controlado con la enzima atrapada

32 LABORATORIO FRENTE A INDUSTRIA
Reactivos TÓXICOS o inflamables Soportes activados con grupos inestables (procesos rápidos) Protocolos complejos Procesos limpios y sencillos Posibilidad de almacenar el soporte activado antes de usar No utilización de reactivos peligrosos

33 INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Interdisciplinaridad e Integración Nuevos Materiales  soportes con mejores propiedades Técnicas de Biología Molecular  dominios de afinidad Química de Superficies Química de Proteínas Interacción Proteínas – Superficies MUCHOS PROBLEMAS DIFERENTES – MUCHAS SOLUCIONES