Biopsia Líquida en el manejo del cáncer

Presentación del tema: "Biopsia Líquida en el manejo del cáncer"— Transcripción de la presentación:

1 Biopsia Líquida en el manejo del cáncer
El cáncer surge debido a la acumulación de alteraciones moleculares de genes que controlan el crecimiento, proliferación y diferenciación celular. Actualmente el perfil molecular de los canceres es valorado usando el DNA y/ó RNA obtenido de fragmentos del tumor primario o de lesiones metastásicas. Hoy dia las estrategias terapéuticas son definidas de acuerdo al perfil molecular de los tejidos pero la capacidad de los tumores de evolucionar en respuesta a una amplia variedad de presiones selectivas endógenas y exógenas implica que la composición genética de los cánceres individualmente es altamente heterogénea, pudiendo existir incluso divergencia molecular entre distintas lesiones metastásicas en un paciente individual. Es necesario tener acceso a la información de este dinamismo. Teodoro Javier Palomino Muñoz Servicio de Análisis Clínicos HGUCR LABCAM, 5 Octubre 2107

2 Destaca el hecho de que las muestras de sangre contienen materiales, que incluyen cfDNA, cfRNA, proteínas, células, vesículas (tales como exosomas), originadas en diferentes tejidos, incluyendo los canceres. El rápido recambio de las células cancerosas conduce a una liberación constante de ácidos nucléicos (ctDNA, tumor derived RNA) y vesículas en la circulación; aparte de células tumorales que se segregan del tumor (CTCs) y entran en el torrente sanguíneo. La posibilidad de investigar la composición molecular de los tumores sólidos y su dinamismo mediante una extracción sanguínea ha generado un enorme el interés en los oncólogos. El término biopsia líquida es a menudo usado para describir este abordaje. NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING 1, 0065 (2017) | DOI: /s |

3 Fortalezas de la biopsia líquida
No invasiva Más rápida Mejor representación de la heterogeneidad tumoral Monitorización de la enfermedad Detección precoz de mutaciones de resistencia Detección precoz de recidiva/progresión Evaluación precoz de respuesta a fármacos El potencial de la biopsia es realmente obvio (introducción de las posibilidades). En cuanto a la monitorización de la enfermedad, la realización de las biopsias líquidas , su alta frecuencia, puede permitir la detección y evaluación precoz.

4 DNA circulante libre (cfDNA) en el plasma sanguíneo
Mandel, P. & Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme [French]. C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 142, 241–243 (1948). Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M. & Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646–650 (1977). Stroun, M. et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients. Oncology 46, 318–322 (1989) >>> ctDNA Nos vamos a centrar en el ctDNA que se puede decir (that arguably) que tiene mayor peso en el momento actual, tanto por trabajos publicados como por utilidad clínica Historia: Cómo aparece este concepto de ctDNA??? La existencia del cfDNA fue descrita en 1948, que lo detectaron en plasma en individuos con cáncer. Leon y colaboradores en 1977 comunican una mayor cantidad de cfDNA en individuos con cáncer que en individuos sin patología cancerosa. Stroun y colegas describen en el cfDNA alteraciones genéticas tumorales en pacientes con cáncer; empezamos a hablar de ctDNA, como una fracción del cfDNA

5 DNA circulante libre (cfDNA) en el plasma sanguíneo Origen
Bone Marrow 80-90 % Tumor % GI Tract 5-10 % Transplanted organ 1-10 % Fetus 1-10 % Origen El origen del cfDNA, inflamación ,autoinmunidad, embarazo, ejercicio, hábito de fumar, disfunción cardiaca han sido reportados como contribuyentes. Todo lo que implique turnover o recambio celular tendrá su importancia : (grandes contribyuentes a este pool de cfDNA son: vemos en la parte superior derecha. Los tumores, incluso superiores (hasta 90%)????? Las CTCs también contribuirían Para el análisis del DNA tumoral (ctDNA) las muestras de plasma son preferibles a las séricas, ya que la cantidad de cfDNA es de 2 a 24 veces mayor en suero. Probablemente debido al DNA liberado de las células inmunes en el proceso e la coagulación, por lo tanto en el plasma se baja el background del DNA wild type

6 Biopsia líquida de otros fluidos biológicos
Diversos estudios han revelado la presencia de ácidos nucléicos derivados de tumor en otros líquidos biológicos como: CSF: La potencialidad del ctDNA del LCR para caracterizar y monitorizar los tumores cerebrales ha sido investigada en comparación con el uso de de ctDNA del plasma. Muestras pareadas de LCR, plasma y DNA de tejido tumoral de pacientes con glioblastoma, meduloblastoma o metastasis cerebrales de cancer de pulmón o pecho fueron analizadas. EL ctDNA de tumores localizados en el CNS era más abundante en el CSF que en el plasma. En cavidad oral: En saliva se han detectado decarcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) mutaciones en TP53, PIK3CA, HRAS, NRAS, en el 100% de pacientes con canceres orales y menos de un 70% en tumores de orofaringe, laringe o hipofaringe, siendo en estos casos más apropiado el plasma. De cavidad oral es más apropiada la saliva En líquido pleural y lavado bronco alveolar: La detección de las mutaciones del EGFR presenta una alta sensibilidad y especificidad con respecto al tejido tumoral, (88% y 100% respectivamente) y correlaciona con la respuesta a los Inhibidores Tirosina Kinasa. Orina: Podemos encontrar DNA transrenal (tr-DNA ). Ya se reportó cuando se detectaron fragmentos del gen SRY del cromosoma Y en orina de mujeres receptoras de transplante renal de donante masculino. La filtración glomerular es altamente selectiva , sólo complejos moleculares inferiores a 6.4 nm(~ 100pb de DNA) pueden pasar al lumen de la nefrona. Se han detectado mutaciones en trDNA de KRAS en carcinomas avanzados de páncreas, en cancer colorrectal y EGFR en cancer de pulmón.(Con amplicones cortos). El DNA de mayor tamaño, ≥1kpb en canceres urogenitales del desprendimiento y rotura de células directamente en el tracto urinario. Muestra interesantísima porque la invasividad será de 000.

7 Tecnologías para análisis de ctDNA. PCR digital.
El futuro de la biopsia líquida en el manejo del cáncer está vinculado a dos tecnologías que`probablemente se utilicen de forma complementaria PCR digital y NGS . La PCR digital requiere a priori el conocimiento del alelo mutante y proporciona el perfil dinámico de las mutaciones individuales. NGS proporciona variantes mutadas nuevas, pero tiene un coste alto y no puede ser inmediatamente aplicada para monitorizar pacientes longitudinamente. PCR digital: Es una amplificación dirigida comparttimentalizada . La sensibilidad de los abordajes tradicionales ,tales como la secuenciación Sanger (10%) en tejido ( mutaciones muy concentradas) ,son insuficientes para la detección de mutaciones en ctDNA plasmático de pacientes con cáncer. Para superar estas limitaciones se ha desarrollado la tecnología digital en la PCR , amplificación dirigida y comparimentalizada de genes mutantes de interés en un fondo de abundantes alelos wild-type, alcanzando límites de detección por debajo de 10-4 % (0.0001%) lo cual es necesario para la detección de aberraciones (rares) en el ctDNA, . (Diapo)Sysmex inostics BEAMing : Se realiza 1.- un aislamiento y preamplificación del DNA del plasma, 2.- Una emulsificacion agua en aceite se crean, en cada pompa o burbuja se aloja una bola magnética recubierta (coated) con primers específicos del gen. 3.- Ocurre la amplificación y posteriormente se recuperan magnéticamente las bolas a una pared (beads con copias amplificadas de DNA wild type o mutante), las gotas de microemulsión, se rompen cuando los beads son atraídos a la pared. Se liberan de la pared y se incuban con sondas específicas mutante y wild type que llevan fluoróforo. 4.- Medición con citometría de flujo.

8 Tecnologías para análisis de ctDNA NGS
Tecnologías para análisis de ctDNA NGS.Secuenciación masiva (Illumina etapas) El flujo de trabajo de Illumina incluye 4 etapas básicas: 1.- Preparación de la biblioteca: Fragmentación al azar seguida ligazón de adaptadores 3´y 5´ (Forward and reverse) a ambos extremos. 2.- Generación de clusters, racimos o agrupaciones: La biblioteca se carga en una célula de flujo donde se capturan se los fragmentos mediante oligos complementarios a los adaptadores de la biblioteca. Cada fragmento unido se amplifica y forma un cluster clonal a través de amplificación tipo puente (cuando desnaturalizamos el fragmento se dobla y el adapter se pega por el extremo. Cuando finaliza la generación de los clusters clonales, los reverse se eliminan and wash up y solo quedan los templates forwards que están listos para ser secuenciados). 3.- Secuenciación mediante síntesis: Se añaden reactivos de secuenciación incluyendo los 4 dNTPs marcados con diferentes moléculas fluorescentes que al incorporarse a en la secuencia naciente emiten a diferente longitud de onda, permitiendo distinguir cual dNTP se ha incorporado. La emisisones de cada cluster o agrupación se registra 4.- Análisis de datos: Las secuencias generadas se alinean al genoma de referencia mediante un poderoso software que puede identificar polimorfismos de nucleótido sencillo, inserciones deleciones, mediante análisis bioinformático.

9 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida ctDNA en diagnóstico temprano del cáncer
De un total de 1, 098 voluntarios sanos de 13 casos con mutaciones KRAS en ctDNA, 6 desarrollan en 25 meses tumores de vejiga y/ó respiratorio. Gormally, E. et al. TP53 and KRAS2 mutations in plasma DNA of healthy subjects and subsequent cancer occurrence: a prospective study. Cancer Res. 66, 6871–6876 (2006). Detección tumoral presintomática tras discrepancias entre el cariotipo fetal y el diagnóstico prenatal no invasivo (NIPT ) realizado mediante Secuenciación paralela masiva .Amant, F. et al. Presymptomatic identification of cancers in pregnant women during noninvasive prenatal testing. JAMA Oncol. 1, 814 (2015). Bianchi, D. W. et al. Noninvasive prenatal testing and incidental detection of occult maternal malignancies. JAMA 314, 162 (2015). Chan et al. en screening de ctDNA de EBV en 1,318 voluntarios asintomáticos detectan DNA viral in 69, en los que posteriormente se reveló la presencia de canceres nasopharyngeos en 3 EBV-positivos, demostrando la utilidad del screening basado en ctDNA . Chan, K. C. et al. Early detection of nasopharyngeal carcinoma by plasma Epstein-Barr virus DNA analysis in a surveillance program. Cancer 119, 1838–1844 (2013). Veamos ahora las posibles aplicaciones clínicas de la biopsia líquida . Una de ellas sería el diagnóstico de patología tumoral Chan y colaboradores en cáncer naso faríngeo, prevalente en el Sudeste asiático demuestran la utilidad del screening basado en el ctDNA de EBV. En un estudio longitudinal prospectivo para estudiar la significacion de mutaciones plasmaticas en individuos sanos Gormally et al observan…… La potencialidad es alta…. Se han reportado detecciones presintomáticas de cánceres en mujeres que se sometieron a NIPT y presentaban discrepancias con el cariotipo fetal. En el estudio de Amant en NIPT, tres pacientes se remiten para resonancia magnética whole body, se detecta cancer de ovario, linfoma folicular y lifoma de Hodgkin. En el estudio de Bianchi, de una cohorte de de NIPT, un 3% fue positivo para una o más aneuploidias (13, 18, 21 X o Y). Se identificaron 8 casos de tumor en las embarazadas (Hodgkin, no Hodgkin (cellula B ), Colorrectales , linfoblástica aguda célulaT) Estos resultados sugieren que el screening de cancer poblacional mediante análisis genómico del plasma puede ser viable, factible. "Si bien este test está disponible en Europa desde 2012, hasta abril de 2016 no ha sido aprobado por la FDA norteamericana. El test de la Septina 9 es un análisis de sangre que detecta la forma metilada del gen SEPT9 y cuya presencia se asocia a la posibilidad de tener un cáncer de colon. Más del 90% de los tumores de colon presente una elevación de esta molécula. La prueba idónea para hacer un cribado del cáncer de colon es la colonoscopia. Por otro lado la determinación de sangre oculta en heces es una prueba habitual de cribado del cáncer de colon pero con menor sensibilidad y especificidad que la septina 9. Muchos pacientes rechazan, por unos u otros motivos, tanto la primera como la segunda. El análisis de sangre de la Septina 9 es una alternativa razonable y sencilla para este tipo de pacientes. En Neolife utilizamos este test en estos casos. Un resultado negativo tiene un alto nivel de fiabilidad en cuanto a la ausencia del cáncer (99,9%), mientras que un resultado positivo indica una probabilidad del 50% de tener el cáncer, por lo que será preciso hacer la colonoscopia".

10 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la enfermedad residual mínima (MRD) y diagnóstico temprano de recidiva- ctDNA como marcador pronóstico APC, KRAS ,TP53 ,PIK3CA La rápida identificación de pacientes con enfermedad residual (MRD positivo), con aumento del riesgo de recaida, podría mejorar el desenlace del paciente a través de terapias proactivas de rescate o de consolidación. También la identificación de pacientes MRD negativos conduciría a la reconsideración en la aplicación atenuada de tratamientos o la eliminación. La biopsia líquida parece ofrecer este tipo de oportunidades en los tumores sólidos: Cuando resecamos el tumor, el ctDNA desaparece en pocas horas, se hace indetectable= 0. la vida media de un fragmento de DNA de bp en general es inferior a las dos horas. En un reconocido estudio de Diehl. et al. Pacientes con cancer colorrectal sometidos a cirugía localizada , las mutaciones que se detectaban en los genes APC, KRAS, TP53 y PIK3CA en las piezas tumorales mediante secuenciación Sanger, eran analizadas en el plasma postcirugía utilizando PCR digital.(162 muestras en 18 pacientes) Vemos en la diapo la secuenciación directa, la cuantificación del DNA total y la técnica digital. Usando este concepto , ctDNA positivos se hacen inmediatamente negativos tras la cirugía, ya que ciertos ctDNAs tienen una vida media muy corta. El aclaramiento del cfDNA es rápido y ocurre via riñones, hígado y bazo (ej. Vida media de 16 minutos en DNA fetal) ; Diehl, F. et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat. Med. 14, 985–990 (2008).

11 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la enfermedad residual mínima (MRD) y diagnóstico temprano de recidiva- ctDNA como marcador pronóstico Previo a cirugía Tercer día post cirugía Día 48 CT scan negativo Día 244 CT scan positivo Fm:13.4% Fm: 0.015% Fm: .11% Fm:0.66% Usando BEAMing , que puede detectar frecuencias mutacionales tan bajas como 0.01% en el cfDNA, en aquellos pacientes en los que se detectaba la mutación recaían dentro del año de la cirugía localizada. Este es un ejemplo de un paciente con mutación en el gen APC, El verde representa los beads unidos a wild type El rojo representa los unidos a mutante. En azúl los beads unidos a fragmentos mutantes y wildtype, resultantes de microgotas que contenían ambos moldes de DNA. Los números en cada cuadrante representan los eventos medidos de cada población. Al tercer día la fracción mutante está en 0.015%(se detecta) El día 48 se sugiere recurrencia de la enfermedad. El día 244 el paciente había recaido. Enfermedad en progresión. CTscan positivo Diehl, F. et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat. Med. 14, 985–990 (2008).

12 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la enfermedad residual mínima (MRD) y diagnóstico temprano de recidiva- ctDNA como marcador pronóstico Predicción de enfermedad recurrente ( det. días 24-48) El CEA es el biomarcador estándar para el seguimiento de la enfermedad en pacientes con cancer colorrectal usado rutinariamnete en el manejo de la enfermedad. Sólo 10 pacientes superaban el límite de referencia para el CEA y todos presentaban niveles detectables de ctDNA antes de la entrada en el estudio. (56% vs 100% de Sensibilidad). La resección tumoral condujo a una reducción mucho más marcada e en ctDNA que en el CEA (decrecimiento medio del 99% frente al 32.5%). Como vemos en la diapo, la predicción de enfermedad recurrente en la determinación postoperatoria era menos patente por el CEA que por el ctDNA, cuando se midió en la primera visita de seguimiento (dias 24-48) Carcinoembryonic antigen (CEA) is the standard biomarker for following disease in subjects with colorectal cancer and is routinely used in the management of the disease10. Only ten of the eighteen subjects had CEA levels >5 ng ml−1 (the boundary of the normal range) before study entry (Table 1). This difference in sensitivity between the two assays (ctDNA versus CEA) was statistically significant; 56% versus 100%, respectively (P = 0.008, McNemar test). Moreover, even in those subjects with positive CEA levels before surgery, complete tumor resection resulted in a much less marked decrease in CEA than that observed with ctDNA (median decrease of 99.0% versus 32.5% in ctDNA versus CEA, respectively; P < 0.001, Student’s t-test). There was a modest overall correlation between CEA abundance and ctDNA levels after correcting for clustering within subjects (R2 = 0.20, P < 0.001, Supplementary Fig. 1b). Finally, when measured at the first post-operative follow-up visit on days 24–48, the ability of CEA levels to predict recurrent disease was less impressive than that of ctDNA levels (P = 0.03 by Mantel-Cox log-rank test, Fig. 3b). Diehl, F. et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat. Med. 14, 985–990 (2008).

13 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la enfermedad residual mínima (MRD) y diagnóstico temprano de recidiva- ctDNA como marcador pronóstico Predicción de recaída metastásica En este otro estudio prospectivo de una cohorte de 55 pacientes en cancer de pecho en estadio temprano recibiendo quimioterapia neoadyvante, la detección de ctDNA en plasma predijo la recaida metastásica con un alto nivel de exactitud. El seguimiento longitudinal de la mutacion incrementaba la sensibilidad para la predicción de recaida , anticipando la recaida en una mediana de 7.9 meses, El seguimiento era cada seis meses. (baseline,postoperatively with the sample taken 2 to 4 weeks after surgery, and then every 6 months during follow-up). Patrones idénticos s obtenían independientemente del estado de receptores progest HER y ER (A) Disease-free survival according to the detection of ctDNA in the first postsurgical plasma sample [HR, 25.1 (95% CI, 4.08 to 130.5)]. P value determined by log-rank test. Data are from n = 37 patients. (B) Disease-free survival according to the detection of ctDNA in serial follow-up samples [HR, 12.0 (95% CI, 3.36 to 43.07)]. P value determined by log-rank test. Data are from n = 43 patients [37 of whom are represented in (A)]. Determinación entre 2º y 4º semana Determinación entre 2º y 4º semana y cada 6 meses durante el seguimiento Garcia-Murillas, I. et al. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Sci. Transl Med. 7, 302ra133 (2015).

14 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la enfermedad residual mínima (MRD) y diagnóstico temprano de recidiva- ctDNA como marcador pronóstico 2-4 weeks 2-4 weeks La detección era mediante dPCR, aquí vemos dos pacientes. Los puntos verdes representaqn el wild type. Los azules representan el mutante. Los marrones mezcla. Lo negros beads sin DNA incorporado. Después de 23 meses, la paciente 001 (superior) que no presenta copias mutantes (2 a 4 semanas post cirugía) se encuentra libre de enfermedad. La paciente 006 en el post ya presenta 7 copias/ml y a los 6 meses es muy patente presentado recaida a los 8 meses post cirugía. (C) Example of dPCR mutation tracking in two patients with early breast cancer, whose tumors harbored the same tumor PIK3CA c.3140A>T (p.H1047L) somatic mutation at the baseline plasma samples. The complete time course for patient A is given in fig. S1. In each dPCR plot, green dots represent WT DNA (VIC-labeled), blue dots represent mutant DNA (FAM-labeled), brown dots represent droplets containing both WT and mutant DNA, and black dots are droplets with no DNA incorporated. Garcia-Murillas, I. et al. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Sci. Transl Med. 7, 302ra133 (2015).

15 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la respuesta- predicción de resistencia 6º relaspso molecular Se anticipa 5 meses al CEA 9º recaida clínica Con respecto a la TERAPIA, Las biopsias líquidas tienen gran potencial en la monitorización de la respuesta y en la evaluación de la resistencia a la terapia. En relación con la monitorización de la respuesta, Reinart y cols., en cancer de colon monitorizan Variantes estructurales somáticas específicas de paciente ( que afectan a locis implicados en el desarrollo de carcinoma colorrectal), obtenidas mediante NGS en tejido tumoral para valorar la eficacia de la resección, la respuesta a la terapia adyuvante y respuesta al tratamiento en relación al diagnóstico de recaida. Monitorización de muestras prequirúrgica, el dia 8, el dia 30 y cada 3 meses hasta fallecimiento. Diseño: El nivel de ctDNA se cuantifica seriadamente mediante ddPCR en seis pacientes que tuvieron recaida de CRC y cinco pacientes sin diagnóstico de recaida, todos ellos intervenidos con propósito curativo. RESULTS: Con el ctDNA, la sensibilidad y especificidad de la recaida postquirúrgica era del 100% . La recaida metastásica se detectaba en media 10 meses antes (2 -15 meses ) que con el seguimiento convencional (El CEA, su anticipación 5 meses oclock, centrado). Estos cambios relevantes en los plazos comparados con la metodología convencional tiene una gran influencia en la capacidad de cambiar la práctica clínica en el manejo del cancer colorrectal. El análisis en el paciente 4, cancer de colon estadio III, parece que la cirugía inicial no fue radical (marcadores positivos el dia 8). La monitorización revela que al sexto mes se detectan variantes, se anticipa 5 meses al CEA y 9 a la recaida clínica. En el paciente 16 (cancer de recto estadio I) la monitorización revela que la recaida molecular se anticipa 6 meses al CEA y 13 meses antes de la recaida clínica. LEAD TIME: pLAZO El CEA elevado como marcador residual tiene sensibilidad del 80% y especificidad del 70%. La anticipación es muy centrada en 5 meses y a continuación de la cirugía Permanece elevado durante varias semanas a pesar de la reseción completa. EL cTDNA es uperior al CEA en todos los aspectos clínicos cuando se trata de monitorizar pacientes con CRC. 6º relaspso molecular Se anticipa 6 meses al CEA 13º recaida clínica ddPCR :Monitorización de muestras prequirúrgica, el dia 8, el dia 30 y cada 3 meses . Reinert T, et al. Gut 2016;65:625–634. doi: /gutjnl

16 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Monitorización de la respuesta
Dawson y cols., en un estudio en cancer de pecho metastásico, con mutaciones en PIK3CA y TP53 detectadas previamente en tejido tumoral, analizan ctDNA. El cual mostró una mejor correlación con las respuestas al tratamiento estándar comparado con los niveles de suero CA 15-3 o recuento de CTCs. Además se mostró como la medida más precoz de respuesta al tratamiento en media 5 meses antes de la deteccíón de enfermedad progresiva utilizando técnicas de imagen (EL QUE MÁS CORRELACIONABA -porque cuando progresa los demás ni se enteran -con la carga tumoral Y EL MAS PRECOZ) Circulating tumor DNA was successfully detected in 29 of the 30 women (97%) in whom somatic genomic alterations were identified; CA 15-3 and circulating tumor cells were detected in 21 of 27 women (78%) and 26 of 30 women (87%), respectively. Circulating tumor DNA levels showed a greater dynamic range, and greater correlation with changes in tumor burden, than did CA 15-3 or circulating tumor cells. Among the measures tested, circulating tumor DNA provided the earliest measure of treatment response in 10 of 19 women (53%). Dawson, S. J. et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199–1209 (2013 )

17 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Predicción de resistencia a la terapia
™ Evolución clonal Tratamiento reactivo Nat Rev Cancer Apr;17(4): Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Wan JC, Massie C, Garcia-Corbacho J, et al. Fragment En la biopsia líquida cuando se ensayan múltiples mutaciones sobre el ctDNA tras el tratamiento, los cambios relativos en el plasma pueden predecir la respuesta del paciente a la terapia dirigida e identificar mecanismos de resistencia. En la parte superior vemos por ejemplo la evolución de la resistencia a los TKI del EGFR mutado. Emergen subclones en presencia de los fármacos la mutación T790M (mutation in exon 20, which leads to substitution of methionine for threonine atposition 790 (T790M) in the kinase domain) aumentaba la afinidad de EGFR por el ATP compitiendo con los inhibidores del dominio tirosina quinasa. El rápido tiempo de respuesta de la determinación del ctDNA permitiría un tratamiento reactivo a los cambios adaptativos del tumor Abajo vemos la evolución del arsenal de TKIs Inhibidores de de PIK3CA : Buparsilib Pictisilib Alpesilib Tasesilib Afatnib Gilotrif™ Osimertinib Tagrisso™

18 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Predicción de resistencia a la terapia
En marzo relapso molecular y en diciembre se confirma con radiología la progresión. (10 meses) Otro ejemplo ,de forma similar , LAS BIOPSIAS LÍQUIDAS han sido utilizadas para identificar mecanismos de resistencia al bloqueo de EGFR mediado por anticuerpos en pacientes con cancer colorrectal: Mutaciones KRAS se detectaban en plasma en el 40% de los pacientes después de 6 meses de tratamiento con cetuximab o panitumumab, no revelando las biospsias obtenidas antes del inicio del tratamiento ninguna mutación en el gen. Los clones mutados se detectaban hasta 10 meses antes de la confirmación de la progresión de la enfermedad mediante radiología (EN LA SECUENCIA DE IMÁGENES VEMOS QUE EN ABRIL APARECE LA MUTACIÓN EN KRAS 10 MESES ANTES DE PD –en rojo gráfico superior-. Misale, S. et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature 486, 532–536 (2012).

19 Aplicaciones clínicas de la biopsia líquida Predicción de resistencia a la terapia
En la tabla se referencian mutaciones clásicass de resistencia adquirida a terapias dirigidas. La BIOPSIA LíQUIDA al presentar una instantánea de la evolución tumoral es una herramienta fundamental para diseñar terapia dirigida: 1.-El seguimiento de las subpoblaciones resistentes puede permitir la selección ESTRATIFICACIÓN de pacientes para el “rechallenge, retratamiento” con el mismo fármaco o similar, por la pérdida de alelo asociado a resistencia ante la ausencia del fármaco (pacientes NSClC perdían el mecanismo de resistencia ante la ausencia del inhibidor proveyendo una nueva oportunidad para su retratamiento con inhibidor EGFR. Aunque los pacientes , 3 recayeron, se provee un periodo de estabilidad de la enfermedad.) 2.- El diseño de terapias combinadas. La combinación de dabrafenib (inhibidor de BRAF) y de trametinib (inhibidor de MEK ) usados en combinación dobla la supervivencia libre de progresión en melanoma metastásico ( eleva a casi 10 meses) . Bien sea en mutantes de como en resistencia adquirida. Ambos convergen en la vía MAPK. 3 .-La identificación de paneles mutacionales específicos a través de la secuenciación del exoma .aunque la sensibilidad del exoma actualmente limita su aplicación a pacientes con cancer avanzado, en los que el el ctDNA es alto (>5% de alelo mutante). , La trazabilidad de las aberraciones genéticas asociadas a resistencia puede permitir al oncólogo adelantar los tratamientos más eficaces antes de que la recaida sea detectada por los examenes radiológicos o clínicos. Entender y ser capaz de contrarrestar farmacológicamete la evolución clonal de un tumor bajo presión selectiva de la terapia es un gran desafío y una tremenda oportunidad -El diseño de paneles de mutación específicos de paciente podría ser una alternativa coste efectividad mejor por su mayor sensibilidad , aunque podrían perderse eventos de novo si no se diseña apropiadamente. El análisis de BRAF (mutación V600E) es obligatorio para seleccionar pacientes con melanoma metastásico para tratamiento con inhibdores de BRAF. También es un marcador de resistencia a agentes anti-EFGR en CCR. El análisis de KRAS (codones 12, 13 ) es obligatorio para seleccionar el tratamineto en CCR (los pacientes no mutados se tratan preferentenmente con terapias anti EGFR. La mutación T790M en el exon 20 de EGFR está presente en más del 60% pacientes de NSCLC que progresan al traamiento de inhibidores TKI , estos pacientes rara vez se rebiopsian. EGFR (delección en el exon 19 y mutación L858R en el exón 21, necesarias para seleccionar para tratamiento con inhibidore s de TKI de NSCLC avanzado, cuand no pueda hacerse la biopsia la muestra de sangre es la única alternativa. Análisis seriados de WGS (intervalos de 26 semanas demuestran adaptciones en numero de copias dinámicas en presión selectiva ante nuevas amplificaciones). 207. Ulz, P. et al. Whole-genome plasma sequencing reveals focal amplifications as a driving force in metastatic prostate cancer. Nat. Commun. 7, (2016).

20 La biopsia líquida en el entorno clínico
La biopsia líquida, de momento, ha entrado en la práctica clínica solamente para el manejo de NSCLC . Las tecnologías de (diagnóstico in vitro device) IVD aprobados (EL MARKETING) hasta la fecha por las agencias reguladoras tales como la FDA y la European Medicine Agency (EMA) basadaS en criterios de seguridad y efectividad SON : Therascreen EGFR RGQ PCR Kit (EMA , Enero de 2015) EGFR Mutation test Cobas v2 (FDA , 2016) Ambos IVDs pueden detectar mutaciones de EGFR en ctDNA de plasma con una exactitud comparable a la secuenciación Sanger de DNA de tejido tumoral. La determinación de las mutaciones de EGFR en ctDNA plasmático para guiar el uso de los EGFR TKIs en NSCLC avanzado, es un claro ejemplo de la utilidad clínica de la biopsia líquida, ya que además en estos pacientes los procedimientos invasivos están descartados. Nat Rev Cancer Apr;17(4): Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Wan JC, Massie C, Garcia-Corbacho J, et al. Fragment

21 La biopsia líquida en el entorno clínico
La biopsia líquida en el entorno clínico. ARMS-Scorpions (Amplificación específica de alelo mutante) 1 4 5 2 1.- Detección mediante PCR de mutaciones somáticas que ocurren en el cancer, que se encuentran en una proporción muy reducida. 2.- Se incorpora un primer es específico para el alelo mutante. 3.- Se incuban sondas moleculares bifuncionales (Scorpions, que incluyen un quencher y un floróforo . El quencher atenua por proximidad la emisión de fluorescencia por el flouoróforo. Esta sonda se une tanto al mutante como al salvaje. 4. Y 5- Se incuba también un bloqueante con quencher (MGB), para impedir que la unión inespecífica del primer específico de alelo mutante a primer salvaje. 6.- Cuando se amplifica el alelo mutante la actividad exonucleasica 5´->3´ libera el flouróforo del quencher . Luego habrá emisión de fluorescencia en presencia del alelo mutante. 3 6

22 La biopsia líquida en el entorno clínico. Therascreen EGFR RGQ PCR Kit
The therascreen EGFR RGQ PCR Kit version 2 capacita la deteccion of 29 mutaciones somáticas en el gen EGFR para pacientes NSCLC con EFGR mutado. Procedure The therascreen EGFR RGQ PCR Kit version 2 uses a two-step procedure. The first step is performance of the control assay to assess the total DNA in a sample. The second step is to complete the mutation assay for the presence or absence of mutated DNA. Applications The therascreen EGFR RGQ PCR Kit version 2 enables detection of 29 somatic mutations in the EGFR gene. These 29 mutations correlate with responsiveness to tyrosine kinase inhibitor therapies, such as gefitinib and afatinib, for patients with non-small cell lung cancer. Some have a sensitizing effect and some are linked to resistance. The therascreen EGFR RGQ PCR Kit version 2 is compliant with EU IVD Directive 98/79/EC, enabling detection of mutations in the EGFR gene for in vitro diagnostics.

23 La biopsia líquida en el entorno clínico. Therascreen EGFR RGQ PCR Kit
La utilidad clínica de therascreen fue confirmada en un ensayo fase IV de gefitinib, en el que 12 de 201 pacientes de los que no se disponía tejido para genotipar portaban mutaciones EGFR al utilizar este ensayo de biopsia líquida. Por otro lado, la prueba tuvo un 34% de falsos negativos (36, de 105 pacientes que fueron positivos en tejido, fueron negativos en plasma) Sensibilidad 65.7% Especificidad 99.8% La EMA comprensiblemente ha recomendado que la etiqueta de Gefitinib establezca que la detección de mutaciones de EGFR en ctDNA se realicen sólo en pacientes que no dispongan de una muestra de tumor evaluable. Usando BEAMing or plasma ddPCR for EGFR se obtienen mejores resultados de concordancia, sensibilidad del orden del 80%. FN: 34% S:65.7% E: 99.8% Douillard, J. Y. et al. Br. J. Cancer (2014)

24 cobas® EGFR Mutation Test v2
El tests Cobas puede hacer todo lo que se indica arriba pero….. El Cobas EGFR Mutation test v2 (FDA , 2016) fué aprobado por la FDA como una prueba complementaria para decidir el tratamiento con erlotinib sólo en presencia de deleciones en el exon 19 o mutaciones de sustitución en el L858R. Si da negativo hay que biopsiar , o probar mutaciones para EFGR en muestras de tejido FFPE Formalin-Fixed Parafin embedded tissue samples. La aprobación está basada en los participantes en el ensayo……..

25 cobas® EGFR Mutation Test v2
Concordancia de positivos: 76.7% (C.I. 70.5%, 81.9%) of tissue-positive specimens, plasma was also positive for an EGFR mutation. Concordancia de negativos: 98.2% (C.I. 95.4%, 99.3%) of tissue-negative cases. La baja (76.7% ) concordancia de los positivos hace especificar a la FDA que los pacientes sin mutación detectable en plasma debería usarse si es posible tejido tumoral. Datos The approval was based on a multicenter, open-label, randomized, Phase III study, to evaluate the efficacy and safety of Tarceva versus gemcitabine plus cisplatin as first-line treatment for stage IIIB/IV NSCLC patients (ENSURE study).  Patients entering the ENSURE study had tumor tissue specimens that tested positive for the EGFR exon 19 deletion or L858R mutations as determined by the cobas EGFR Mutation Test v1. Five hundred seventeen of the 601 (86.0%) patients screened for the ENSURE study with valid cobas EGFR Mutation Test v1 test results had available plasma samples available.  Of the patients enrolled, 98.6% (214/217) had a plasma sample available for testing.  The agreement between the cobas EGFR Mutation Test v2 in plasma and the cobas EGFR Mutation Test v1 in tissue was evaluated for detection of EGFR mutations (Ex. 19del and L858R mutations) in NSCLC patients screened for participation in ENSURE.  . The drug efficacy of TARCEVA, based on the cobas EGFR Mutation Test v2 in plasma, was evaluated by bridging to the drug efficacy based on the cobas EGFR Mutation Test v1 in tissue in the ENSURE study. The patients whose plasma results were positive for exon 19 deletion and/or an L858R mutations treated with erlotinib had improved progression-free survival (PFS) compared to those treated with chemotherapy.    The cobas EGFR Mutation Test v2 for use with plasma test is intended to be used to initially screen patients with metastatic NSCLC for EGFR mutations.  Those patients in whom no exon 19 deletion and/or an L858R mutation is detected in their plasma specimens should then be reflexed to having their EGFR status determined from their FFPE tissue specimen. 

26 cobas® EGFR Mutation Test v2
Tejido Plasma Vemos que en un subset de pacientes cuyos resultados positivos para las delecciones del exon 19 y/ o L858R en plasma (en los positivos para la mutación en plasma , no tejido tumoral) el erlotinib mejoraba el PFS comparado con aquellos que recibían quimioterapia, de forma similar a la PFS de mutación en tejido. El plasma es una buena referencia, lo que ocurre en plasma ocurre en tejido, aumentando la sensibilidad hay que pasar de tejido a plasma. Es un problema de sensibilidad. Background: The phase III, randomized, open-label ENSURE study (NCT ) evaluated first-line erlotinib versus gemcitabine/cisplatin (GP) in patients from China, Malaysia and the Philippines with epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation-positive non-small-cell lung cancer (NSCLC). Conclusion: These analyses demonstrate that first-line erlotinib provides a statistically significant improvement in PFS versus GP in Asian patients with EGFR mutation-positive NSCLC (NCT ). The patients whose plasma results were positive for exon 19 deletion and/or an L858R mutations treated with erlotinib had improved progression-free survival (PFS) compared to those treated with chemotherapy. 

27 cobas® EGFR Mutation Test v2
Vemos otro ejemplo de estudio que señala la misma equivalencia en la respuesta clínica para el plasma (59%) que para el tejido (61%) en este caso para Osimertinib (TKI tercera generación) en T790M positivos, en cancer de pulmón avanzado- doblando a los T790M negativos. Por tanto se puede predecir la respuesta al Osimertinib utilizando igualmente el plasma que el tejido. Este test ha sido evaluado para detectar la mutación T790M en un análisis combinado de dos estudios retrospectivamente en fase II de Osimertinib AURA y AURA2 , pero sólo con un % de acuerdo de positivos plasma-tejido El test cobas EGFR Mutation Test v2 ha sido aprobado también por la FDA par la detección de la mutación T790M en muestras tisulares, pero no en plasma. El porcentaje de acuerdo de positivos es de 61.4, tejido-plasma, parecido a las delecciones del exon 19 y mutación de substitución de L585R en ctDNA usando el mismo test.

28 La biopsia líquida en el entorno clínico.
Esta falta de sensibilidad nos obligaría a seguir un esquema similar…. El plasma sería válido cuando fuera positivo. Si es negativo habría que acudir si o sí al tejido. Como ejemplo de praxis, debido a la falta de sensibilidad se puede seguir el esquema……. Oxnard, G. R. et al. Association between plasma genotyping and outcomes of treatment with osimertinib (AZD9291) in advanced non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 34, 3375–3382 (2016).

29 Secuenciación digital
Secuenciación de un gen Una Interesante tecnología que merece la pena desctacar, la secuenciación digital, que aumenta la sensibilidad al reducir los artefactos de la amplificación mediante la secuenciación de amplicones multiplex usando códigos de barras moleculares La prueba Guardant con un panel de 70 genes se presentó en el último Meeting Anual de la ASCO, con resultados espectaculares.. La concordancia plasma tejido para un subset de 400 pacientes , la mayor parte NSCLC y cáncer colorrectal, era del 87% y cuando la recogida de tejido y plasma no difería más de 6 meses llegaba al 98%. La mutación de resistencia EGFR T790M sólo se detectaba en el DNA del plasma de pacientes tratados con EGFR TKIs, esto es, no se detectaba en muestras pre tratamiento. La prueba Guardant 360 es muy sensible (el ctDNA que representa 0,4% del cfDNA de la sangre podía ser detectado) y posibilita la detección de mutaciones de resistencia en EGFR, ALK y KRAS que no se detectaron en las respectivas muestras de biopsia tumoral en casi un tercio de los pacientes. 1.- El primer 5´-3´ specific reverse lleva un barcode y un primer común. 2.- Eliminación de primers y primer dimers 3.- Amplificación limitada del amplicon formado usando un primer forward y un primer común 4.- Eliminación de primers y primer dimers 5.- Adición de los adaptadores de secuenciación, durante la amplificaci´on universal. 6.- Eliminación de adapter primers y primer dimers . 7 .- Listo para control de calidad de biblioteca y secuenciación En la secuenciación de uno de los genes vemos en azúl un falso positivo y en rojo una verdadera variante, pues aparece en los diferentes códigos de barra o índices moleculares únicos. Amplicón para un gen con varios códigos de barra moleculares

30 Conclusiones Hasta hoy, la biopsia líquida (ctDNA) ha entrado en la práctica clínica solamente para el manejo del NSCLC (estratificación de pacientes para recibir una terapia dirigida concreta). La biopsia líquida tiene un gran potencial pero debe superar muchas barreras antes de llegar plenamente a la práctica clínica. Muchos estudios pilotos y retrospectivos indican que el análisis del ctDNA puede superar a los biomarcadores convencionales actualmente utilizados y ampliar su uso a más contextos clínicos (terapia dirigida). Pero para ello, para obtener altos niveles de evidencia, se precisa: La realización de amplios estudios controlados en los que el ctDNA sea el criterio de valoración principal y que estén acompañados de una estandarización que se extienda a cada etapa del proceso. La pregunta clave es: LOS TRATAMIENTOS DIRIGIDOS POR LA BIOPSIA LÍQUIDA SE TRADUCIRÁN EN RESULTADOS SATISFACTORIOS ? nrclinonc s1.doc Hasta hoy, la biopsia líquida (ctDNA) ha entrado en la práctica clínica sólamente para el manejo del NSCLC (estratificación de pacientes para recibir una terapia dirigida concreta). La biopsia líquida tiene un gran potencial pero debe superar muchas barreras antes de llegar plenamente a la práctica cínica. Muchos estudios retrospectivos (que generan datos de hipotesis prometedores ) y pilotos, (proof of concept) indican que el análisis del ctDNA puede superar a los biomarcadores convencionales actualmente utilizados y ampliar su uso a más contextos clínicos (terapia dirigida). Pero para ello, para obtener altos niveles de evidencia, se precisa: La realización de amplios estudios controlados en los que el ctDNA sea el criterio de valoración principal y que estén acompañados de una standarización que se extienda a cada etapa del proceso: Plasma vs serum Extracción y almacenamiento para mejorar la sensibilidad para detectar alteraciones moleculares raras. Técnicas para cuantificación de mutaciones (digital PCR, NGS BEAMing). Más de 60 ensyos se están llevando a cabo Ver tabla. La pregunta clave es: LOS TRATAMIENTOS DIRIGIDOS POR LA BIOPSIA LÍQUIDA SE TRADUCIRÁN EN RESULTADOS SATISFACTORIOS.

31 FIN. Muchas gracias.