Diagnóstico Molecular de Giardia lamblia en niños de séptimo año de tres poblaciones de Ecuador, optimización y validación de la técnica. Aguilar Mora.

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1 Diagnóstico Molecular de Giardia lamblia en niños de séptimo año de tres poblaciones de Ecuador, optimización y validación de la técnica. Aguilar Mora Fabian, Ruano Nieto Ana, Oña Cisneros Fabian. Instituto Nacional de Investigacion en Salud Publica PROPAD

2 La infección del hombre por G. lamblia tiene un carácter cosmopolita
La infección del hombre por G. lamblia tiene un carácter cosmopolita. Sin embargo, la endemicidad de esta parasitosis es mayor en los países económicamente subdesarrollados. La Organización Mundial de La Salud (OMS) ha estimado que aproximadamente millones de personas de esas naciones están infectadas por el citado protozoo. En Asia, África y América Latina, alrededor de 200 millones de personas desarrollan manifestaciones clínicas a causa de la giardiasis y 500 mil nuevos casos son reportados anualmente (1). Como G. lamblia (sinónimo: G. intestinalis o G. duodenalis) es la única especie capaz de infectar a los humanos, así como a una variedad de mamíferos, es la especie con mayor importancia dentro del género, a tal punto que la Organización Mundial de la Salud (OMS) desde los años veinte le ha reconocido su potencial zoonótico (2,3)

3 Población de estudio 275 Muestras Quito = 47 muestras Loja = 43 muestras Guayaquil = 185 muestras

4 Talleres Toma de Muestras Toma de Medidas

5 Imagen 1. Gel electroforesis 2X (1) DNA Ladder 100 pb (2-3) ADN total de muestra de heces con diagnostico positivo para Giardia lamblia conservada en etanol 70% (4-5) ADN total de muestra de heces con diagnostico positivo para Giardia lamblia conservada en dicromato de potasio 2.5%.

6 Imagen 2. Cuantificacion mediante espectrofotometria (1-2) blank elution buffer (3-4) ADN total de muestra de heces con diagnostico positivo para Giardia lamblia conservada en etanol 70% (5-6) ADN total de muestra de heces con diagnostico positivo para Giardia lamblia conservada en dicromato de potasio 2.5%.

7 Primers Utilizados Subunidad menor del ribosoma RNA
Primer Forward 5’ GACGGCTCAGGACAACGGTT 3’ Primer Reverse 5’ TTGCCAGCGGTGTCCG 3’ Subunidad menor del ribosoma RNA Cuadro 1. MASTERMIX Reactivos 1 X H2O grado molecular 13.8 µl goTaq Flexi Buffer 5x 5 µl Mg Cl2 25mM 2.5 µl dNTP mix 10mM 0.5 µl Primer Fw 1 µl Primer Rv goTaq Hot Start Polimerasa 0.2 µl ADN muestra Volumen Total 25 µl

8 Imagen 3. Diluciones seriadas Giardia + 105,4 ng/µl (1) 1 en 10 10,54 ng/µl (2) 1 en 100 1,05 ng/µl (3) 1 en ,105 ng/µl (4) 1 en (5) 1 en (6) 1 en (7) 1 en (8) 1 en (9) 1 en (10) 1 en

9 Imagen 4. Gel electroforesis 2X probando diferente concentración de primers.

10 Imagen 5. Gel electroforesis 4X (1) DNA Ladder 100 pb (2-11) Giardia Etanol (12-21) Giardia Dicromato (2-3, 12-13) 58°C (4-5, 14-15) 56,2°C (6-7, 16-17) 55°C (8-9, 18-19) 54°C (10-11, 20-21) 53,3°C.

11 Imagen 6. Desnaturalizacion 94°C 5‘ Alineamiento 60°C 30‘‘ Elongacion 72°C 45‘‘

12 Imagen 7. Diagnostico Molecular Giardia en etanol 70% y dicromato de Potasio 2,5%. Gel Agarosa 2% 30‘ 100V. TBE buffer 1X. Sybr Safe

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16 GRACIAS

17 BIBLIOGRAFIA 1. Fonte Galindo Luis, Almannoni Saleh Ali. Giardiasis A zoonosis? Rev Cubana Hig Epidemiol [revista en la Internet] Ago [citado Mayo 21]; 48(2): Disponible en: 2. WHO. Parasitic zoonoses. Geneva: World Health Organisation;1979. Contract n° 637. 3. Meloni B, Thompson R, Strandén A, Kohler P, Eckert J. Critical comparison of Giardia duodenalis from Australia and Switzerland using isoenzyme electrophoresis. Acta Trop 1991 Dec; 50 (2):