Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias

Presentación del tema: "Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias"— Transcripción de la presentación:

1 Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias

2 Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su género podemos seguir el siguiente esquema.

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4 CITOCROMOOXIDASA O PRUEBA DE LA OXIDASA
Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos. Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo con solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco (disco comercial de papel impregnado de tetrametil-para-difenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta = prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa negativo.

5 Oxidasa Consideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias que provengan de medios de cultivo que no contenga hidratos de carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar) NEG POS

6 PRUEBA DE OXIDACIÓN FERMENTACIÓN (O-F)
Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los microorganismos no fermentadores. Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estéril.

7 Prueba OF

8 Interpretación: Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino después de la incubación, conservando su color original.

9 ONPG (O-NITROFENIL-β-GALACTOPIRANÓSIDO)
Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de la lactosa La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la célula bacteriana. Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+). Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)

10 ONPG Procedimiento: Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretación: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo es productor de β-galactosidasa= prueba (+). Consideraciones Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.

11 Pruebas Bioquímicas Citrato Ureasa Voges-Proskauer Rojo de metilo
Sulfuro Indol Movilidad (SIM) Movilida, Indol, Ornitina (MIO) Triple azúcar Herro (TSI) Agar Lisina Hierro (LIA) Fenilalanina

12 Citrato COLOR: VERDE INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL
SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO

13 Principio Es una sal del acido cítrico. Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas de la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como única fuente de carbono. La medición de esta característica es importante para identificar muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a probar debe carecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono.

14 La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la producción de subproductos alcalinos.

15 El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo que produce la alcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido de amonio (NH4OH).

16 El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6.

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18 Medio de Cultivo El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la formula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta).

19 Procedimiento Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48 horas.

20 Resultados La prueba positiva esta representada por la producción de color azul oscuro en el termino de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de productos alcalinos.

21 La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es valido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase logarítmica de crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado carbono y nitrógeno.

22 Ureasa COLOR: ROSADO INDICADOR: ROJO FENOL SUSTRATO PRINCIPAL: UREA

23 Principio Es una diamida del acido carbónico Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del medio.

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25 Procedimiento El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar. La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas.

26 Resultados Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o mas. Las reacciones son las siguientes:

27 Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.

28 2. Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio. Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.

29 3. Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

30 Voges-Proskauer

31 Principio Voges-Proskauer es un epónimo doble, en honor de dos microbiólogos que trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en observar la reacción de color rojo producida en medios de cultivo adecuados después del tratamiento con hidróxido de potasio. Luego se descubrió que el producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de la vía del butilenglicol.

32 El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de acetoina (acetil metil carbinol). Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia producen acetoina como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos. En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoina se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.

33 Medios de cultivo B. Reactivos A. Caldo VP/RM
El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer (MR/VP) según la formula de Clark y Lubs. B. Reactivos oc-naftol al 5%. intensificador de color a-naftol 5 g Alcohol etilico absoluto 100 mL Hidroxido de potasio al 40%, agente oxidante Hidroxido de potasio 40 g Agua destilada 100 mL A. Caldo VP/RM Polipeptona 7g Glucosa 5 g Fosfato dipotasico 5 g Agua destilada 1 L pH final = 6,9

34 Procedimiento Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar. Incubar 24 horas a 35 °C. Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

35 Resultados Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas después del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la acetoina. La prueba no debe leerse mas allá de una hora después de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso.

36 Rojo de Metilo

37 Principio El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho mas bajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de acido del sustrato de hidratos de carbono que se utilice. La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de acido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos fuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa.

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39 Medios de cultivo B. Reactivos A. Caldo VP/RM
El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer (MR/VP) según la formula de Clark y Lubs. B. Reactivos Indicador de pH rojo de metilo. Rojo de metilo, 0,1 g en 300 ml de alcohol etílico al 95%. Agua destilada, 200 ml. A. Caldo VP/RM Polipeptona 7g Glucosa 5 g Fosfato dipotasico 5 g Agua destilada 1 L pH final = 6,9

40 Procedimiento 1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas). 2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al caldo.

41 Resultados Positivo: El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente producción de acido como para disminuir el pH a 4,4.

42 Negativo: Como otros microorganismos pueden producir pequeñas cantidades de acido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prueba positiva.

43 Indol SIM: Sulfuro indol movilidad MIO: Movilidad indol ornitina

44 Principio Es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. La prueba del indol se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido. En la practica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato.

45 SIM: Sulfuro indol movilidad
Determinar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro y por último la capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano.

46 Producción de ácido sulfhídrico
Producción de Indol Movilidad

47 Producción de ácido sulfhídrico
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.

48 Producción de Indol El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético. La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.

49 Medios y reactivos Caldo triptofano (triptofano al 1%)
Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g Cloruro de sodio 0,5 g Agua destila da 100 ml Reactivo de Kovac Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml p-dimetilaminobenzaldehido 10 g HCI concentrado 50 ml Reactivo de Ehrlich p-dimetilaminobenzaldehido 2 g Alcohol etílico 190 ml HCI concentrado 40 ml

50 Procedimiento Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a 35 °C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.

51 Resultados Ácido sulfhídrico: Positivo: ennegrecimiento del medio Negativo: Sin ennegrecimiento

52 Indol: Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie del medio indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la formación de indol. La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa. Si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

53 Movilidad Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad. Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

54 MIO: Movilidad, Indol, Ornitina
Composición del medio: Extracto de levadura Peptona L-Ornitina Dextrosa Agar Agua Indicador de pH: púrpura de bromocresol Ácido: amarillo pH 5.2 Alcalino: Púrpura pH 6.8 Medio no inoculado: Púrpura intenso brillante pH 6.0

55 Principio El MIO se utiliza para la identificación de enterobacterias sobre la base de movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa e indol. Descarboxilación de ornitina Producción de indol Movilidad

56 Descarboxilación de ornitina: mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

57 Producción de indol: El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético.

58 procedimiento Inoculación: picadura en forma vertical
Tiempo: hrs Temperatura °C

59 Resultados Ornitina descarboxilasa Positivo: color púrpura del medio
Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final Indol: Positivo: anillo rojo en la superficie del medio Negativa: No se Produce color / Color naranja en la superficie del medio, indica desarrollo de escatol

60 Movilidad: Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad. Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

61 TSI: Triple azúcar Hierro

62 Principio Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.

63 La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior) El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y concentración 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar. Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.

64 El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol.
A 6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán un color amarillo (fermentador de glucosa)

65 Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermentador de glucosa)
Si el color rojo es mas intenso que el original, hay alcalinización (no es miembro de la familia enterobacteriaceae)

66 Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa.
Después de hrs, el medio permanece amarillo, reacción ácido sobre ácido (A/A). Fermentador de lactosa. La producción de gas romperá el agar o lo empujara hacia arriba. Reacción A/A más gas.

67 Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos.
El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante. 18-24 hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina sobre ácido K/A. Las bacterias que fermentan glucosa también pueden formar productos alcalinos a partir de la utilización de la peptona, sobre la zona inclinada. Reacción K/K.

68 procedimiento Inoculación: picadura y estría en pico de flauta. Tiempo: hrs Temperatura:35-37°C

69 Resultados K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida). Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella. A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida). Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter. K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa

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72 LIA: Agar Lisina Hierro
COLOR: LILA INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL SUSATRATPOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUCOSA

73 Principio Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente alcalinidad.

74 procedimiento Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano. Temperatura: 35-37°C Tiempo hrs

75 Resultados A: ácido K: alcalino N: neutra R: Rojo (desaminación oxidativa)

76 K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia
K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia. Desaminación oxidativa/descarboxilación. K/A: azul de Prusia/lila. No desaminación. Producción de H2S: Enegrecimiento del medio Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paredes del tubo.

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79 FENIL-ALANINA-DESAMINASA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima FENIL-ALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo. Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela con cloruro férrico. Interpretación: El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la enzima, al agregar sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.

80 Fenilalanina (-) (+)