Inducción de proteína recombinante

Presentación del tema: "Inducción de proteína recombinante"— Transcripción de la presentación:

1 Inducción de proteína recombinante
b-Lactamasa

2 Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes son aquellas que se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Se obtiene al expresar un gen clonado en la línea celular de interés. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento 80% Expresar un gen de eucariontes en bacteria..... conformación modificaciones postraduccionales .... depende de la complejidad de la proteína

3 Sistemas biológicos de producción de PR
Bacterias E. coli B. subtilis Células eucariontes Hongos Levaduras Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris y otros metilotrófos Hongos filamentosos Células animales en cultivo Células de insecto en cultivo Plantas Maximizar la expresión de proteínas codificadas por genes clonados

4 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
1 Aislamiento del gen 2. Clonación y expresión Producción de la proteína Transcriptasa reversa Enzimas de restricción Célula huésped DNA polimerasa Ligasa Clones Sonda de DNA Véctor Medio de cultivo

5 Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli)

6 Vector de clonación pET-24a(+)

7 Vector de recombinación pET- TEM-1
7200 bp

8 Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra terminadora de la transcripción

9 El sistema de expresión también debe tener las siguientes características:
Cromosoma de Escherichia coli

10 Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

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12 El inductor del operón lac que utilizaremos será el isopropiltiogalactósido (IPTG).

13 Análogos de la lactosa

14 Procedimiento general de clonación

15 NEB Cutter

16 Diseño de primers u oligos

17 Ligación

18 DH5 Alfa BL21

19 Purificación de la proteína recombinante

20 Procedimiento de proteína recombinante
Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB Incubar con agitación a 37 ͦC hasta OD Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final) Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Cada vez que se tome una alícuota centrifugar y quedarse con el sobrenadante Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar y correr en SDS-PAGE.

21 Peculiaridades de la construcción:
En el vector pET-TEM se insertaron los genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio

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23 RESULTADOS DEL ALGUN SEMESTRE EN EL PASADO
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