Clonado, purificación y evaluación de dos regiones del antígeno P30 para discriminación entre la fase aguda y crónica de la infección de toxoplasmosis.

Presentación del tema: "Clonado, purificación y evaluación de dos regiones del antígeno P30 para discriminación entre la fase aguda y crónica de la infección de toxoplasmosis."— Transcripción de la presentación:

1 Clonado, purificación y evaluación de dos regiones del antígeno P30 para discriminación entre la fase aguda y crónica de la infección de toxoplasmosis Cardona, M. P.*; Costa, J. G.*; Carral, L.**; Kaufer, F.**; Lagier, C.***; Marcipar, I. S*. * Laboratorio de Tecnología Inmunológica, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe. ** Laboratorio de Toxoplasmosis, Hospital Alemán, Ciudad Autónoma de Bs. As. ***IQUIR-CONICET, Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Rosario. Objetivo Principal: Optimizar el diagnóstico de infección aguda por Toxoplasma gondii mediante una proteína que sea reconocida únicamente por los Acs de pacientes que se encuentran en esta fase. Objetivo Parcial: Clonar, expresar, purificar y ensayar dos regiones del antígeno P30 de T. gondii. El T. gondii es un protozoo de multiplicación intracelular estricta e infecta a una amplia variedad de mamíferos, entre ellos al humano. Esta parasitemia se denomina toxoplasmosis y genera complicaciones en mujeres embarazadas que se infectan durante la gestación, porque si no se trata adecuadamente existe alto riesgo de transmisión congénita con graves consecuencias para el feto. Es por lo tanto de suma importancia el diagnóstico certero de la fase aguda de la infección durante el embarazo. Se ha demostrado que P30, el antígeno de superficie mayoritario de T. gondii, está involucrado en los primeros pasos de la invasión. Se encuentra conservado entre la mayoría de las cepas del parásito.  Se clonaron dos regiones codificantes del Ag P30 , P30c y P30L (fig. 1), en los vectores pET-32a y pRSET-B respectivamente. Ambas proteínas se expresaron en la bacteria E. coli BL21 DE3 (fig. 2). En la fig. 3 se observan las fracciones de proteínas solubles e insolubles del total que expresa la célula. La purificación se llevó a cabo a partir de la fracción de proteínas solubles mediante la utilización de columnas con zinc inmovilizado, ya que ambas secuencias se clonaron en vectores que agregan regiones de aminoácidos de poli-histidina a las proteínas. Problemas de purificación: Ciertas proteínas poseen un plegado que enmascara las regiones de poli-histidina. Co-purificación de proteínas propias de las bacterias hospedadoras junto a la proteína de interés. Se obtuvieron resultados satisfactorios con P30L empleando urea (conc. 4M), es decir en condiciones desnaturalizantes. Con la P30c aun no se pudieron resolver los problemas de purificación mencionados. En la fig. 4, 5 y 6 se observan eluciones de la purificación de P30L. En las fig. 5 y 6 se observan las fracciones de purificación empleando urea y en la fig 4 sin urea. Se realizó una evaluación preliminar del antígeno P30L mediante ELISAs detectando IgG de sueros de individuos con infección aguda (SA), crónica (SC) o no infectados (SN). Se ensayaron diferentes concentraciones del antígeno (0,5 y 1 ug/pocillo) y del conjugado anti-IgG(1/1000, 1/2000, 1/3000). Si bien se observa que las señales entre SN y SC son similares, ambas son inferiores a las señales de SA. Empleando el conjugado 1/2000 se encuentra la mayor diferencia entre SA y SC. La mejor concentración de antígeno fue 0,5 ug/poc. Si bien no hay una total discriminación entre sueros de individuos infectados en fase aguda con los que se encuentran en fase crónica, los resultados obtenidos con la P30L son prometedores. Por lo tanto, próximamente se optimizará la purificación de la P30c y se seguirá perfeccionando la técnica ELISA para ambos antígenos. Finalmente se evaluará el procedimiento con un mayor panel de sueros.