DRA. SILVANA PERTUZ FACULTAD DE CIENCIAS UNAM

Presentación del tema: "DRA. SILVANA PERTUZ FACULTAD DE CIENCIAS UNAM"— Transcripción de la presentación:

1 DRA. SILVANA PERTUZ FACULTAD DE CIENCIAS UNAM
CCL11 (eotaxina-1), y su papel en la modulación de la respuesta inmume inflamatoria en un modelo de amebiasis DRA. SILVANA PERTUZ FACULTAD DE CIENCIAS UNAM

2 QUIMIOCINAS Proteínas de bajo peso molecular que regulan la respuesta inmunológica. Desde el punto de vista estructural han sido divididas en 4 familias dependiendo de la disposición de cisteína en el amino-terminal de estas moléculas. Estas familias son: CC; CXC, CXXXC, CX. Las quimiocinas cumplen roles importantísimos en a regulación de la respuesta inmunológica tanto en la homeostasis como en la enfermedad.

3 CUMPLEN VARIAS FUNCIONES

4 LA PRINCIPAL FUNCIÓN ES LA INDUCCIÓN DE LA MIGRACIÓN DE LAS CÉLULAS INMUNOLOGICAS

5 LO CUAL PODEMOS VER REFLEJADO EN LA UNCIÓN GLOBAL DEL SISTEMA INMUNOLOGICO

6 CCL11 INDUCE LA ACTIVACIÓN Y LA MIGRACIÓN DE EOSINOFILOS…

7 CCL11 ESTA LIGADO A ESTADOS DE CRONICIDAD EN CASOS DE ALERGIA E INFECCIONES PARASITARIAS, Y ALGUNOS DESORDENES DE AUTOINMUNIDAD

8 EN EL CASO ESPECIFICO DE LA AMIBIASIS NO ESTA ESTABLECIDO EL PAPEL DE EOTAXINA(ccl11)
TNF-α IL-1β Quimiocinas CXCL-8; CXCL-1 INF- ? Eliminación E. histolytica Activación de Macrófagos

9 OBJETIVO EFECTO DE CCL11EN EL RECLUTAMIENTO DE EOSINOFILOS EN UN MODELO DE AMIBIASIS

10 MATERIALES Y METODOS AISLAMIENTO DE GRANULOCITOS DE SANGRE PERIERICA HUMANA USANDO PERCOLL. Sangre periférica humana (25 ml), fue tomada de donantes voluntarios sanos, de acuerdo al protocolo estándar y siguiendo las normas de ética del Instituto de Investigaciones Biomédicas (UNAM). El paquete celular, se deja asentar (2hr), y luego se diluye en buffer de lisis de eritrocitos (1/1; 155mM NH4C; 10 mM KHCO3, 0.1mM EDTA), por 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, la suspensión celular se centrifugo a 4ºC 300xg/10min. El pellet conteniendo la suspensión celular diluida en PBS- 2 mM EDTA, fue dispensado sobre el gradiente de Percoll (1.08 de densidad; 9.5ml/1.5 ml de HBSS, y 4 ml AD), en una proporción 15ml/35ml Percoll/suspensión celular respectivamente, y siguiendo el protocolo estándar (MACS Protocols), se recupero la capa de sobrenante y se resuspendio en HBSS, verificando viabilidad y en preparaciones por citosping se analizó la morfología de los granulocitos aislados.

11 MATERIALES Y METODOS TRANSMIGRACIÓN DE LOS GRANULOCITOS EN TRANSWELL BAJO FACTORES AMEBIANOS. La suspensión celular-HBSS se coloca sobre la membrana de policarbonado (2 µm de diámetro de poro), de acuerdo a las condiciones establecidas. Los factores amebianos probados fueron proteínas del tipo proteasa de cisteína-2- adhesina (EHCP2, Activada, y comprobada en geles de gelatina). La EHCP-2 fue resuspendida en PBS-DTT (1 mM) a 30min, 37ºC. Posteriormente, EHCP2 (2.5 µM) fue incubada con CCL11 (100 ng/ml) durante 30 min (Establecido en cinética), bajo las mismas condiciones, la reacción fue parada con un coctel de inhibidores para proteasas. Para algunos experimentos, EHCP2 fue inhibida con inhibidor de proteasas E-64 (25 µM). Entonces, los granulocitos (aislados de sangre periférica humana), fueron etiquetados con Calceína-AM (2 µm), según protocolo estándar e incubados con CCL11 con/sin EHCP2 en la cámara Boyden (14 transwells), a 37ºC durante 90 min. Análisis de densidad celular fue obtenido del analizador de imagen FX. ANALISIS ESTADISTICO. Los datos de densidad celular fueron comparados por t-Student pareada a un nivel de confianza del 95% y a un nivel de significancia del 0.05.

12 RESULTADOS FACTORES AMIBANOS INDUCEN EL RECLTAMINETO DE EOSINOFILOS AL SITIO DE INFECCIÓN AL MODIFICAR LAS FUNCIONES DE CCL11, ESTO SE PUEDE SUPONER QUE OCURRE EN ESTADOS DE CRONICIDAD DE LA INFECCIÓN

13 RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Los resultados muestran que el factor amebiano probado (EHCP2), induce el reclutamiento de granulocitos humanos aislados de sangre periférica (95% eosinofilos), ex-vivo. Lo cual se muestra cuando CCL11 es incubada con el complejo amebiano y los granulocitos, condiciones en la cual se observa un marcado reclutamiento de granulocitos humanos que siguen el gradiente formado por la CCL11 activada por EHCP2. Por estudios realizados en la plataforma de bio-informática para el estudio de secuencias de proteínas y su conformación (Expasy), se encontró que EHCP2 modifica la actividad de las quimiocinas al generar la modificación estructural de las mismas, en un trabajo ya publicado se demostró que rompe quimiocinas CCL en los primeros 8 aminoácidos del N-terminal generando péptidos truncados que inhiben la función de estas quimiocinas5. infección.

14 RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
En el caso de CCL11 muy posiblemente genere una molécula con actividades quimioatrayentes potenciadas que induce la copiosa transmigración de los granulocitos humanos. De lo que podemos deducir el papel que tienen los eosinofilos y graulocitos en general en el desarrollo de la amibiasis, y desde este punto de vista, lo que podemos deducir es que Entamoeba histolytica está induciendo una respuesta TH2, que este modelo especifico tiende a la cronicidad de la enfermedad, y por lo tanto está induciendo un estado de tolerancia que favorece el desarrollo de la amibiasis, esto es partiendo de la idea de que es una respuesta de tipo TH1 la que mejor media el control de esta infección. En conclusión en el modelo de amibiasis CCL11 juega un papel importante en el desarrollo de una respuesta de tipo tolerogénica al inducir el reclutamiento de eosinofilos que contribuyen a estados avanzados y crónicos de la