ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO

Presentación del tema: "ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO"— Transcripción de la presentación:

1 ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO
1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

2 ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO
1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

3 ¿CÓMO ENTENDER UN FENÓMENO BOLÓGICO?
Atracción por la luz Dos posibles aproximaciones: -1) Extraer proteínas, RNA, metabolitos … de individuos antes y después de entrar en contacto con la luz y buscar diferencias. Problemas: complejidad de los resultados, falta de sensibilidad … -2) Buscar individuos o generar mutantes que no se sientan atraídos. Identificar los genes afectados. Problemas: no se encuentren esos individuos, mutantes triviales …

4 COMPLEJIDAD DEL DESARROLLO

5 ¿Cómo se sabe que los productos de estos genes intervienen?
¿Cómo se sabe qué genes están en la misma ruta? ¿Cómo se sabe el orden de actuación de los que están en la misma ruta?

6 EL VALOR DE LOS MUTANTES
El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura wt Mutante A B D C Fenotipo normal C* anormal Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica … El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde y cómo actúan los genes y el orden en que intervienen en un proceso El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lo hacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura

7 EL VALOR DE LOS MUTANTES
Regulación de la síntesis de aas en S. cerevisae Medio completo Medio sin His wt Síntesis aas ↓ Síntesis aas ↑ Mut tra3 Síntesis aas ↑ Síntesis aas ↑ Mut aas1, aas2, aas3 Síntesis aas ↓ Síntesis aas ↓ Síntesis aas AAS1 AAS2 AAS3 TRA3 Síntesis aas

8 EL VALOR DE LOS MUTANTES
La combinación de mutantes en un mismo individuo da pistas sobre cómo interaccionan los productos de los genes afectados Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b): -1) Muestra tanto el fenotipo A como el B Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes de Mendel) -2) Fenotipo wt, o casi wt Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes. -3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B) Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …) -4) Muestra el fenotipo A o el B Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro. Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.

9 EL VALOR DE LOS MUTANTES
Regulación de la síntesis de aas en S. cerevisae wt Síntesis aas ↓ Mut tra3 Síntesis aas ↑ Mut aas1, aas2, aas3 TRA3 Síntesis aas AAS1 AAS2 AAS3 tra3; aa3 Síntesis aas ↓ aa3 epistático sobre tra3 tra3; aa1 tra3; aa2 Síntesis aas ↑ tra3 epistático sobre aa1 y sobre aa2 ¿Orden en que actúan estos genes?

10 LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO
Luz azul FOTOTROPISMO Luz azul Fitocromo A (phyA) influye en el proceso ¿phyA actúa preferentemente en el núcleo o en el citoplasma? CITOPLASMA NÚCLEO phyA FHL FHY1 Sin phyA está afectado el fototropismo Sin phyA en el núcleo apenas lo está CONCLUSIÓN: phyA actúa principalmente en el citoplasma PERO …

11 LA IMPORTANCIA DEL FENOTIPADO
Ahora notamos que phyA sí hace algo importante en el núcleo para el fototropismo: MÁS LENTO en fhy1fhl WT phyA-NLS-GFP fhy1fhl phyAfhy1fhl phyA Fenotipado más fino: seguir la velocidad del proceso phyA actuaría sin importar si está en el núcleo, o en el citoplasma CITOPLASMA NÚCLEO phyA FHL FHY1 phyA phyA-NLS En plantas SIN phyA endógeno: todo el phyA está en el núcleo

12 ESQUEMA DE UNA FLOR TÍPICA

13 LA IMPORTANCIA DE LOS MUTANTES
Hay mutantes en los que está alterado el patrón floral, NO la morfología de sus partes. En esos mutantes no hay cualquier tipo de alteración. Ver qué tipos se dan y cuáles no permite comprender cómo tiene lugar el proceso.

14 Mutante “A” Estructura floral: carpelos, estambres, estambres, carpelos

15 Mutante “B” Estructura floral: sépalos, sépalos, carpelos, carpelos

16 Mutante “C” pétalos en vez de estambres
Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor

17 Mutante “C” Una nueva flor en vez de carpelos
Estructura floral: sépalos, pétalos, pétalos, nueva flor

18 sépalo pétalo estambre carpelo B B A C C A 1 2 3 4 3 2 1

19 ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO
1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

20 GENES DE EFECTO MATERNO
(+/-) (-/-) Fenotipo normal (+/-) Fenotipo determinado por el genotipo de la madre, NO por el del individuo (+/-) Fenotipo anormal

21 EFECTO MATERNO CLÁSICO
¿CUÁNTO DE LA MADRE? El caso de Bicoid ♂ ♀ +/- x -/- Vive ♂ ♀ -/- +/- x Mueren ♂ ♀ +/- -/- x Viven Todo el producto del gen necesario para el desarrollo viene de la madre: EFECTO MATERNO CLÁSICO

22 ¿DÓNDE EN LA MADRE? ♂ ♀ ♂ ♀ -/- +/- +/+ x Muere -/- +/- +/+ x Viven
Mosaico +/- +/+ x Muere ♂ ♀ -/- Mosaico +/- +/+ x Viven El producto del gen necesario para el desarrollo viene de las gónadas maternas

23 ¿CUÁNTO DE LA MADRE? ♂ ♀ ♀ ♂ ♂ ♀
El caso de Engrailed (letal en homocigosis) ♂ ♀ -/- Mosaico +/- x Muere ♀ ♂ +/- x -/- Muere ♂ ♀ -/- Mosaico +/- x Vive Mismos defectos Sólo importa el genotipo del cigoto: EFECTO CIGÓTICO CLÁSICO

24 Se necesita un aporte materno ¿pero produce algo el embrión?
¿CUÁNTO DE LA MADRE? -/- Muere ♀ ♂ +/- Extra sex combs (esc) Se necesita un aporte materno ¿pero produce algo el embrión? ♂ ♀ +/- x +/- Vive ♀ -/- ♂ Diferente por lo que ha producido el embrión -/- ♀ -/- ♂ T2 y T3 como T1 NO TODO el producto del gen necesario para el desarrollo viene de la madre

25 ANÁLISIS GENÉTICO Y EL ESTUDIO DEL DESARROLLO
1) Mutantes ¿por qué son útiles? 2) Genes de efecto cigótico y materno 3) Encontrar los genes: programas de mutagénesis a) El “screening” de Heidelberg de mutantes cigóticos en Drosophila b) Problemas en otros organismos: pez cebra y ratón c) Peculiaridades de Arabidopsis d) Tratando de encontrar más: el uso de marcadores y “screenings” de modificadores 4) Series alélicas, su importancia y obtención 5) Estudio de los genes encontrados a) Análisis de mosaicos: mutaciones autónomas y no autónomas b) Cómo obtener mosaicos c) Cómo marcar los sectores mutantes d) Modificaciones del sistema de mosaicos e) Análisis de epistasias: ordenar los genes en una ruta

26 DISEÑO GENERAL , … x Mutagénesis y obtención de mutantes INDIVIDUALES x , … Amplificación por separado de cada mutante individual Típicamente no pueden distinguirse los distintos individuos Cruces entre hermanos de cada familia , ¿Fenotipo de interés de los mutantes en homocigosis? Mantener la mutación desde los heterocigotos, ¿cómo distinguirlos? , En especies AUTOFECUNDABLES se obtienen los homocigotos sin necesidad de amplificación previa de cada mutante individual

27 3a) EL “SCREENING” DE HEIDELBERG (DROSOPHILA)

28 DROSOPHILA COMO SISTEMA
Ventajas generales: Fácil y barato de mantener Tiempo de generación corto (10 dias) Produce mucha progenie

29 DROSOPHILA COMO SISTEMA
Ventajas genéticas: Sin recombinación meiótica en machos Sólo cuatro cromosomas Cromosomas politénicos visibles al óptico Muchos caracteres externos variables (ojos, nervios en las alas, quetas…) Un gran repertorio de técnicas y trucos Genoma completamente secuenciado

30 EL SCREENING DE HEIDELBERG
Primer intento de hacer una búsqueda global de mutantes del desarrollo. ¿No sería inmanejable el número de genes que intervienen en el proceso? ¿Servirían de algo esos mutantes, serían informativos?

31 EL SCREENING DE HEIDELBERG
Cosas importantes a tener en cuenta: ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener todo. Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar Planificar un esquema de cruzamientos para obtener individuos con las mutaciones y poder conservarlas. Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés. Se buscaron genes cigóticos que mataran al embrión: no llegarían a salir larvas del huevo.

32 CICLO VITAL DE DROSOPHILA

33 EL SCREENING DE HEIDELBERG
Cosas importantes a tener en cuenta: ¿Qué tipo de mutantes quiero encontrar? No se puede tener todo. Disponer de un sistema simple y eficaz para mutagenizar Planificar un esquema de cruzamientos para obtener individuos con las mutaciones y poder conservarlas. Tener un sistema para distinguir los mutantes de interés. Se buscaron genes cigóticos que mataran al embrión: no llegarían a salir larvas del huevo. Esas mutaciones deberían causar alteraciones morfológicas visibles en la cutícula

34 LA CUTÍCULA EMBRIONARIA

35 LA CUTÍCULA EMBRIONARIA

36 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Se hace mutagénesis de un buen número de machos de modo que un cierto porcentaje de sus espermatozoides tengan mutaciones

37 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Los machos mutagenizados se cruzan “en masa” con hembras normales x F1 Todos los descendientes son heterozigotos. Por lo general, cada uno para una mutación distinta.

38 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Para los mutantes recesivos es preciso obtener individuos homozigotos. Pero, ¿cómo conseguirlos? x 1/4 La autofecundación “en masa” de la F1 NO generará casi nunca homozigotos para cada mutación sino dobles mutantes en heterozigosis porque típicamente de cada mutación sólo hay 1 individuo en la F1

39 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Cruzando POR SEPARADO cada macho F1 con hembras wt se obtiene en cada cruce (botella) 1/2 de heterozigotos para cada mutación. x F2 1/2 1/2 Hemos conseguido amplificar cada mutación: ya hay varios individuos con la MISMA mutación que luego podrán cruzarse entre ellos (No haría falta si fueran hermafroditas capaces de autofecundarse)

40 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga x 1/2 1/4 de los cruces Todos wt

41 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga 1/2 x 1/2 1/2 de los cruces 1/2 1/2

42 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Si se deja que las moscas de cada botella se crucen entre ellas aparecerán algunos homozigotos para la mutación que contenga 1/2 x 1/2 1/4 de los cruces 1/4 1/2 1/4 Fenotipo visible

43 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Resumen de los resultados de la autofecundación en botellas donde había un mutante 1/2 x 1/2 1/16 6/16 9/16 Entre los hermanos de los mutantes habrá portadores de la mutación, pero también muchos wt

44 ¿Cómo hacer mutagénesis?
El experimento se simplificaría si hubiera algún modo de eliminar automáticamente los individuos “a” y “b” F1 x 1/2 a F2 1/2 x 9/16 b F3 1/16 6/16

45 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Una posibilidad es usar letales recesivos (r) y letales dominantes inducibles (D) D r F1 x r r D r F2 D r

46 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Pero si hay recombinación en la hembra el sistema puede destruirse D r D r Meiosis x r r …

47 ¿Cómo hacer mutagénesis?
Los recombinantes que se producen entre cromosomas que difieren en una inversión dan descendientes inviables. En Drosophila hay sistemas de cromosomas con inversiones, CROMOSOMAS BALANCEADORES, que pueden emplearse para evitar este problema. El “screening” se hace por separado para cada cromosoma

48 El “screening” de Heidelberg
EMS w r B w x D w r B w D F1 Se mutagenizan con EMS varios miles de machos que después se cruzan con hembras vírgenes “en masa”

49 El “screening” de Heidelberg
w r B r B x w D D 29º 4 dias 18º o 25º w D w r B D r B D r B F2

50 El “screening” de Heidelberg
w r B w r B x w 1/4 r B 1/2 Mueren como larvas F3 CRITERIOS DE SELECCIÓN: -1)no hay moscas de ojos blancos; -2)de 1/4 de los huevos no salen larvas; -3)observación embriones

51 RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2
1500 machos mutagenizados se cruzaron con unas 2500 hembras vírgenes x D r B w EMS

52 RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2
1500 machos mutagenizados se cruzaron con unas 2500 hembras vírgenes cruces individuales de F1, 5764 dieron suficiente descendencia w r B D x

53 RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2
w 1/4 r B 1/2 Mueren como larvas 4217 de las F2 no dieron descendientes de ojos blancos (73% → 1.3 mut/crom) Poisson, no media 2843 daban 25% huevos de los que no salían larvas

54 RESULTADOS DEL “SCREENING” EN EL CROMOSOMA 2
Examen a la lupa de los embriones de las 2843 líneas 1620 líneas son letales embrionarios auténticos 321 muestran defectos claros cutícula Análisis de complementación: 61 genes, 48 con más de 1 alelo, 13 con 1 alelo

55 ASPECTO DE ALGUNOS MUTANTES

56 MUCHOS MUTANTES CON PROBLEMAS EN LOS SEGMENTOS

57 LOS MUTANTES SUGIEREN APARICIÓN PROGRESIVA DE PATRONES
Zonas a lo largo del eje A/P 14 parasegmentos Borde anterior y posterior de cada parasegmento Identidad de cada región

58 SATURACIÓN DEL “SCREENING”
¿Qué fracción de los genes que se podría encontrar con este protocolo de trabajo se ha encontrado realmente? ¿Merece la pena seguir buscando con este protocolo? Criterio 1: seguir la marcha del proceso Cada vez se encuentran menos GENES nuevos Constantemente aparecen mutantes, pero … El caso del cromosoma 2 de Drosophila:

59 SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Criterio 2: número de alelos por gen. Cuantos más haya, más cerca de la saturación. El caso del cromosoma 2 de Drosophila: Aproximadamente 4,55 alelos/locus (hay mejores aproximaciones) ¿Podemos predecir cuántos genes quedan por encontrar? Asunción clásica: la distribución de frecuencias de alelos sigue una Poisson La fracción de genes sin mutar (0 alelos) será: P(0)= e-m Caso del cromosoma 2: m=4,55, P(0)= 0,01. El 1% del total de genes que se podrían encontrar no se ha mutado aún, quedarían menos de 1 (0,6)

60 SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Problema: muchas veces la distribución no parece una Poisson. Previsible si no todos los genes tienen la misma probabilidad de recuperarse como mutantes. El caso del cromosoma 2 de Drosophila: Poisson para m = 4,55 alelos/locus Fuerte exceso de loci con una mutación Posteriormente se han encontrado 8 genes más en este cromosoma con el tipo de problema buscado en el “screening” original. Esos 8 loci representan el 11,6% del total de 69 loci, P(0)=0,116, mucho más que lo previsible según Poisson (P(0)=0,01)

61 SATURACIÓN DEL “SCREENING”
Criterio 3: análisis de deleciones. ¿Las hay que causen un fenotipo de interés pero en las que no mapee uno de los loci identificados? El caso del cromosoma 2 de Drosophila: Crom. 2 Deleciones (cubren 30% del cromosoma) Deleciones dando fenotipos cuticulares Loci de mutantes previamente identificados En todas mapea alguno de los loci identificados (compatible con saturación)

62 3b) PROBLEMAS EN OTROS ORGANISMOS: PEZ CEBRA Y RATÓN

63 EL PEZ CEBRA COMO SISTEMA MODELO DE VERTEBRADOS
Pequeño tamaño (3-4 cm) Tiempo de generación corto (3-4 meses) Alta fecundidad ( huevos/hembra) Fácil de mutagenizar Embrión transparente y de desarrollo externo Se puede fecundar “in vitro”. Esperma congelable

64 “SCREENINGS” EN EL PEZ CEBRA
Amplificación de cada mutante en una familia F2 1/4 de los cruzamientos entre los F2 darán individuos homozigotos para m: con fenotipo visible Varias peceras, cada una con cruces entre parejas de hermanos F2

65 “SCREENINGS” DEL PEZ CEBRA
“SCREENING” DE TÜBINGEN 49 MACHOS MUTAGENIZADOS 3075 FAMILIAS F2 INICIADAS 2746 FAMILIAS F2 ANALIZADAS ( cruces para dar F3) 4624 MUTANTES OBTENIDOS 1163 MUTANTES CONFIRMADOS 372 GENES IDENTIFICADOS 150 GENES CON MÁS DE 1 ALELO 222 GENES CON 1 ALELO Nº alelos/gen: de 1 a 34. Nº medio: 2.4 Development 123:1-36 (1996) “SCREENING” DE BOSTON 266 MACHOS MUTAGENIZADOS 2799 FAMILIAS F2 INICIADAS 1808 FAMILIAS F2 ANALIZADAS (más de cruces para dar F3) 2383 MUTANTES OBTENIDOS 695 MUTANTES CONFIRMADOS 220 GENES IDENTIFICADOS 56 GENES CON MÁS DE 1 ALELO 164 GENES CON 1 ALELO Nº alelos/gen: de 1 a 11. Nº medio: 1.5 Development 123:37-46 (1996)

66 “SCREENING” DE HAPLOIDES
Ventaja: Enseguida se detectan mutaciones interesantes Problemas: -1)Los embriones haploides acaban muriendo -2)Los embriones haploides tienen algunos problemas de desarrollo

67 MÉTODOS ALTERNATIVOS Presión poco después de la fertilización:
NO se completa la meiosis II y embriones diploides Problema: no son completamente homocigotos Choque térmico tras fertilización: NO se completa 1ª mitosis tras meiosis y embriones diploides y completamente homocigotos Problema: pobre viabilidad (10-20%) “Screeining” de haploides ya visto

68 EL RATÓN COMO MODELO Es un mamífero (cercano al hombre)
Genoma secuenciado Transformable y sistemas “knock out” Corto tiempo de generación (2 meses) Desarrollo embrionario intrauterino Requerimientos de espacio en jaulas Pocos programas de mutagénesis a gran escala: unos 300 mutantes dominantes (visibles en G1) desde más de ratones, pocos de desarrollo

69 DISEÑO DE UN CROMOSOMA BALANCEADOR EN RATÓN
Sin Wnt3 el ratón muere Ag da color amarillento al pelo Puro y Neo dan resistencia a antibióticos Se obtiene un gen Hprt funcional, Hprt permite crecer en medio HAT ca. 1/3 del cromosoma con la inversión

70 UN BALANCEADOR PARA EL CROMOSOMA 11
Color amarillento de partes del cuerpo de los ratones portadores de la inversión

71 ESQUEMA DEL “SCREENING”
Ratones macho Marcador dominante REX: pelo rizado Mutación Camadas de más de 24 ratones sin animales negros indican un mutante recesivo letal

72 3c) PECULIARIDADES DE ARABIDOPSIS

73 MUTAGÉNESIS EN ARABIDOPSIS
Meristemo apical del embrión Nº células del meristemo que contribuirán a las semillas de la planta = 2 en Arabidopsis Sector m/+ +/+ Como cada individuo se autofecunda no hace falta una generación previa de amplificación del número de individuos m/+