Introducción y principios generales

Presentación del tema: "Introducción y principios generales"— Transcripción de la presentación:

1 Introducción y principios generales
Lección 1 Introducción y principios generales

2 ALGUNAS CUESTIONES BÁSICAS
¿Qué moléculas son los principales “componentes activos” en las células? Las proteínas (enzimas, componentes de sistemas de señalización …) ¿Qué determina la actividad de una proteína? Su estructura 3D, que viene condicionada por su estructura primaria Dónde está en un organismo, cuándo aparece y cuánto lo hace ¿Puede replicarse una proteína? No, la estructura 1aria de una proteína no puede pasar de una molécula de proteína a otra. Eso sí es posible en los ácidos nucleicos ¿Dónde está contenida la información sobre la estructura 1aria de una proteína? En los ácidos nucleicos: en la región codificante de los genes ¿Dónde está contenida la información sobre el dónde, cuándo y cuánto? En los ácidos nucleicos: en la región promotora de los genes y en la estructura de la cromatina ¿Dónde están situados los genes en los eucariotas? En los cromosomas, cada cromosoma es una molécula de DNA lineal que contiene un número variable de genes y suele haber varios cromosomas por célula

3 ALGUNAS CUESTIONES BÁSICAS
¿Qué es el locus de un gen? La posición dónde se encuentra en un cromosoma ¿Son iguales todas los genes de un determinado tipo presentes en los individuos de una especie? No, suele haber variantes: son los alelos ¿Un carácter, un gen? Para la gran mayoría de los caracteres NO: varias proteínas intervienen en un proceso, su expresión está controlada por otras proteínas y RNAs y su actividad por sistemas de señalización sensibles a cambios ambientales. Por tanto, lo habitual es: un carácter, varios genes + influencias ambientales ¿Controlado genéticamente = inflexiblemente determinado? No siempre, porque la actividad de las proteínas se ve modificada por efectos ambientales ¿Un gen, un carácter? Una proteína suele tener siempre el mismo tipo de actividad pero si cambia el contexto en el que actúa puede hacerlo el efecto final en el organismo. Consecuencia: en muchas ocasiones el mismo gen afecta a diferentes caracteres. Otra posibilidad: un gen da varios productos (“splicing” alternativo)

4 TIPOS DE GENES EUCARIOTAS
-1) Su producto final es una proteína -2) Su producto final es un RNA -rRNA o tRNA Transcritos por RNApol específicas Productos estables Tendencia a estar agrupados en el genoma -miRNA Transcritos por la RNApol II Productos pequeños e inestables Dispersos por el genoma -lncRNA

5 “Pool” de alelos del gen “a”
ALELOS DE UN GEN Mutación Individuos a3 a4 a16 a34 a2 a18 a5 a6 a12 a1 a1/a1 a1/a12 Deriva a4/a8 Selección negativa . “Pool” de alelos del gen “a” en la especie

6 ¿GEN → CARÁCTER? a b c d e f g CARÁCTER X Ca2+ 1 5 2 3 4
Genes 1, 2, 3, 4, 5 Señal ambiental Un gen afecta a varios caracteres Un carácter afectado por varios genes Efectos ambientales TF1 TF1-P k b c d m r CARÁCTER Y 6 7 2 3 Gen 2 Receptor Señal Carácter Y: Genes 2, 3, 6, 7 Señal ambiental

7 “SPLICING” ALTERNATIVO
a-tropomiosina Es probable que lo sufra la mayoría de los genes en eucariotas

8 GENES DELATORES Delator transcripcional ¿dónde se transcribe el gen?
Delator traduccional ¿dónde se acumula el producto? Gen de interés ¿Efecto de la cromatina en esa zona del genoma?: inserción dirigida del delator lacZ (β-galactosidasa) GUS (β-glucuronidasa) GFP Luciferasa

9 ¿CÓMO ENTENDER UN FENÓMENO BIOLÓGICO?
Atracción por la luz Dos posibles aproximaciones: -1) Extraer proteínas, RNA, metabolitos … de individuos antes y después de entrar en contacto con la luz y buscar diferencias. Problemas: complejidad de los resultados, falta de sensibilidad … -2) Buscar individuos o generar mutantes que no se sientan atraídos. Identificar los genes afectados. Problemas: no se encuentren esos individuos, mutantes triviales …

10 REQUISITO PREVIO Sólo puede estarse seguro de que un gen afecte a un carácter si disponemos de más de un alelo de ese gen: VARIABILIDAD AA Bb Cc CC bb cc BB Aa Bb CC AA bb aa BB ? ? Tres genes controlan el carácter en esta especie pero sólo podemos detectar en cada población el efecto de dos (los variables)

11 ¿CÓMO OBTENGO LOS MUTANTES?

12 ¿GENES TAMAÑO OREJAS? -Parto de las variantes que hay ya en la naturaleza (variabilidad natural) -Hago mutagénesis y busco mutantes de interés (“screening”) Mutagénesis

13 GRAN VARIABILIDAD NATURAL
Un genoma humano típico difiere del de referencia en millones de sitios. La mayoría (> 99%) son SNPs o cortos “indels” 2100 a 2500 son variaciones estructurales (que afectan en total a unos 20 millones de pares de bases): -unas 1000 delecciones grandes -unas 160 variantes de nº de copias -unas 915 inserciones de Alu -unas 128 inserciones de L1 -unas 51 inserciones SVA (retrotransposones SVA) -unas 4 NUMTs (inserciones de DNA mitocondrial en el genómico) -unas 10 inversiones Variantes en un individuo típico que pueden afectar a la función génica: sitios que causan truncación proteína a sitios que causan cambios de secuencia en proteína sitios en zonas UTR y promotores Datos de “A global reference for human genetic variation” The 1000 genomes Project consortium Nature 526:68-74 (2015) basados en 2504 individuos de 26 poblaciones

14 “SCREENING” CLÁSICO Cada gen puede estar o no mutado en algún individuo. Cuantos más individuos más probabilidad de tener mutaciones en todos los genes … Mutagénesis AL AZAR Individuos SIN fenotipo de interés SE DESCARTAN ¿No mutado? ¿Gen no relacionado? Análisis del fenotipo en búsqueda de individuos donde sea de interés Identificación del gen mutado en los individuos con el fenotipo de interés. Algunos genes importantes para el proceso en estudio se encontrarán muchas veces, otros ninguna “Screening” SATURADO: todos los genes que se podían encontrar con el método usado se han encontrado

15 “GENOME-WIDE SCREENING”
Cada gen estará mutado en algún individuo Identificar todos los genes Mutarlos uno a uno … Individuos SIN fenotipo de interés SE CONSERVAN Su interés radica en que tiene un gen mutado. Otros fenotipados pueden detectar algo Colecciones de interés PÚBLICO Fenotipar cada individuo Asignación de una función a cada gen SI ES QUE al mutarse origina un fenotipo detectable

16 GENES → FUNCIONES: DOS ESTRATEGIAS Y DOS APROXIMACIONES

17 GENÉTICA DIRECTA/ REVERSA
PASOS A SEGUIR: Mapear la región del genoma afectada en el mutante; identificar el gen; clonarlo; comparar secuencias de los alelos wt y mutante * Gen afectado Genética directa: del mutante al gen, de la función al gen Mutante (función del gen) PASOS A SEGUIR: Cambiar la secuencia del gen en el organismo (obtener un mutante); identificar alteraciones producidas; predecir la función del gen Gen Genética reversa: del gen al mutante, del gen a la función Mutante (función del gen)

18 APROXIMACIÓN INDIVIDUAL vs SISTEMÁTICA
Mi gen favorito Mi mutante favorito Genética directa Genética reversa INDIVIDUAL GEN FUNCIÓN Colección de mutantes (individuos o genes) Mutagénesis AL AZAR SISTEMÁTICA Individuos wt Genoma Genética directa Genética reversa DE CADA UNO de los genes “Genome-wide screening” GENES FUNCIONES

19 ¿QUÉ GEN ESTÁ MUTADO?

20 ¿DÓNDE ESTÁ EL GEN AFECTADO EN EL MUTANTE?
APROXIMACIÓN CLÁSICA: ¿En qué cromosoma está? ¿En qué posición en ese cromosoma? Para contestar lo anterior debemos saber cómo se hereda en relación con otros genes de posición ya conocida (MARCADORES): Debemos estimar con qué frecuencia se separa nuestro alelo mutante de alelos de los marcadores a los que estaba asociado, frecuencia de RECOMBINACIÓN Loci situados en distintos cromosomas: 1/2 probabilidad de que se separen Loci situados en el mismo cromosoma: < 1/2 probabilidad de que se separen (tanto menor cuanto más cerca estén) NUEVAS APROXIMACIONES: Secuenciar el genoma de individuos estrechamente emparentados con y sin la mutación, comparar las secuencias e identificar los cambios relevantes “Tilling arrays” con DNA de individuos con y sin la mutación

21 MAPEO CON “TILLING ARRAYS”
Región del genoma Oligonucleótidos de la región “Tilling array” Hibridación sondas de DNA wt y mutante con el “array” Hibridación con DNA wt Hibridación con DNA mutante Localización del mutante

22 MAPEO POR RECOMBINACIÓN
Nuestro mutante: m Marcador A/a AAmm Indv 1 aaMM Indv 2 X Alelos A y m asociados en un genomio Alelos a y M asociados en el otro Am aM Prog 1 X aamm Prog 2 Descendientes parentales: se mantiene los alelos asociados como en el progenitor Am aM Descendientes recombinantes: se han separado los alelos asociados a m A M Frec. Recom ~ 1/2: en distintos cromosomas Frec. Recom < 1/2: en el mismo cromosoma

23 GENES CON LOCI EN DISTINTOS CROMOSOMAS

24 MEIOSIS DE UN DIHÍBRIDO
A B a b Segregación INDEPENDIENTE de cada pareja de cromosomas homólogos Probabilidad: ½ Probabilidad: ½ 1/4 1/4 Combinaciones recombinantes 1/2 * (1/4 + 1/4 + 1/4 + 1/4) =1/2 (RF = 50%) Combinaciones parentales 1/2 * (1/4 + 1/4 + 1/4 +1/4) = 1/2

25 CRUZAMIENTO PRUEBA DE UN DIHÍBRIDO
1/4 1/4 RF = 50% Proporción 1:1:1:1

26 GENES CON LOCI EN EL MISMO CROMOSOMA (GENES LIGADOS)

27 EFECTO DEL SOBRECRUZAMIENTO ENTRE LOS LOCI
Sólo con sobrecruzamiento Sólo se DETECTAN si ocurren ENTRE dos loci HETEROCIGOTOS Sin sobrecruzamiento no hay gametos recombinantes para los loci en el MISMO cromosoma

28 TIPOS DE DIHIBRIDOS DE GENES LIGADOS
Ligados en fase de ACOPLAMIENTO (CIS) Ligados en fase de REPULSIÓN (TRANS)

29 CRUZAMIENTO PRUEBA DE UN DIHÍBRIDO CIS
Si hay SIEMPRE sobrecruzamiento entre esos dos loci (frec. sobrec = 100%) se obtiene 50% de gametos recombinantes (1/4 + 1/4), es decir, RF= 50% Recombinantes desde un trans Parentales desde un trans RF < 50% = Si RF=1% los loci están separados 1cM y CADA uno de los dos tipos de gametos recombinantes aparece en proporción de 0.5%

30 DISTANCIA GENÉTICA-DISTANCIA FÍSICA
Pocos sobrecruzamientos en la heterocromatina. Poca distancia en el mapa genético pero mayor distancia física Zona con muchos sobrecruzamientos. Distancia genética desproporcionada Por término medio en humanos 1 cM equivale a pb. En levaduras 1 cM equivale a unas 6000 pb

31 LA RF NUNCA SUPERA EL 50% Aunque los loci en estudio estén
muy alejados y siempre haya sobrecruzamientos no puede haber más de un 50% de recombinantes Entre dos loci no se puede distinguir si ha habido sobrecruzamientos simples o múltiples: se subestima la distancia y se subestima tanto más cuanto más alejados estén. Solución: loci intermedios Meiocitos con más de un sobrecruzamiento también dan como máximo 50% de recombinantes

32 ¿ES LA MUTACIÓN EN EL GEN MAPEADO REALMENTE LA CAUSA DEL FENOTIPO?

33 RESCATE DE UN MUTANTE C. elegans wt unc-104 UNC-104::GFP
Se mueven lentamente y sin coordinación Se quedan paralizados y enrollados UNC-104::GFP Rescate del mutante, se mueven de nuevo normalmente

34 ¿QUÉ INFORMACIÓN DAN LOS MUTANTES?

35 ¿Cómo se sabe que los productos de estos genes intervienen?
¿Cómo se sabe qué genes están en la misma ruta? ¿Cómo se sabe el orden de actuación de los que están en la misma ruta?

36 EL VALOR DE LOS MUTANTES
El gen afectado debe estar implicado en la formación de esa estructura wt Mutante A B D C Fenotipo normal C* anormal Identificar componentes de una ruta (de señalización, metabólica … El análisis de los mutantes da pistas sobre dónde y cómo actúan los genes y el orden en que intervienen en un proceso (EPISTASIAS) El tipo de alteraciones que se observan en los mutantes y los que no lo hacen pueden dar pistas sobre cómo se genera una estructura

37 POSIBLES FENOTIPOS -Un único fenotipo. Esperable si el gen tiene una única función. -Más de un fenotipo (PLEIOTROPÍA). Posibilidades: INTERESANTE: el gen tiene varias funciones en distintos momentos o lugares. MENOS INTERESANTE: hay una relación trivial entre los fenotipos (un mutante causa parálisis y malnutrición porque al no moverse el individuo no puede alimentarse) -No todos los mutantes muestran el fenotipo (PENETRANCIA INCOMPLETA): por cambios aleatorios de expresión alrededor de un valor umbral; por interacciones con otros genes o el ambiente … -No todos los mutantes muestran el fenotipo en el mismo grado (EXPRESIVIDAD VARIABLE) -Sin fenotipo. El gen pasa inadvertido.

38 DUPLICACIONES GÉNICAS
Duplicación Divergencia con el tiempo Dos posibilidades * Actividades del producto ligeramente diferentes Expresión ligeramente diferente de los genes Si muta uno de los genes a veces el otro podrá suplirle: no aparece fenotipo o es débil. Efecto de la REDUNDANCIA

39 TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de pérdida de función (“loss-of-function”) -Mutantes nulos (“null mutants”) o amorfos (“amorphic mutants”) Suelen ser recesivos. El arquetípico sería una deleción. Se consideran como muy útiles para determinar la función de un gen. Útiles en estudios de epistasia. -Mutantes de pérdida parcial de función o hipomorfos (“hypomorphic mutants”) Suelen ser recesivos. Si no se reconocen como tales sus fenotipos pueden dar problemas de interpretación y son nocivos para los estudios de epistasia

40 * * Test para un mutante nulo Mutante haploinsuficiente (DOMINANTE)
+/+ m/+ m/m m/Df + * Test para un mutante nulo mismo fenotipo +/+ M/+ wt mutante Mutante haploinsuficiente (DOMINANTE) wt mutante +/+ m/+ m/m m/Df + * wt mutante Test para un mutante hipomorfo m/m/m ≠ fenotipo

41 TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-of-function”) -Mutantes sobreproductores (“over-producers”) o hipermorfos (“hypermorphic mutants”) Suelen ser dominantes. El producto del gen sigue apareciendo en los mismos lugares y momentos. Posibilidades: más expresión del gen; el producto es más estable; producto más activo ... Útiles para determinar la función de un gen si hay redundancias. Útiles en estudios de epistasia

42 Test para un mutante sobreproductor
+ +/+ M/+ M/M M/Df * +/+ M/+ M/M M/Df mutante wt Test para un mutante sobreproductor

43 TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-of-function”) -Mutantes sobreproductores (“over-producers”) o hipermorfos (“hypermorphic mutants”) -Mutantes de expresión ectópica (“ectopic expression”) o neomorfos (“neomorphic mutants”) Suelen ser dominantes. El producto del gen aparece en sitios o momentos donde no lo hace normalmente. Útiles para determinar la función de un gen si hay redundancias. Nocivos en estudios de epistasia

44 MUTANTE ANTENNAPEDIA X
EXPRESIÓN ECTÓPICA: mutante dominante (ganancia de función) Segmento anterior como uno posterior: POSTERIORIZACIÓN X Cada región viene especificada por una combinación de genes homeóticos

45 TIPOS DE MUTANTES Mutantes o alelos de ganancia de función (“gain-of-function”) -Mutantes sobreproductores (“over-producers”) o hipermorfos (“hypermorphic mutants”) -Mutantes de expresión ectópica (“ectopic expression”) o neomorfos (“neomorphic mutants”) -Mutantes dominante-negativos (“dominant negative”) o antimorfos (“antimorphic mutants”) El producto del alelo mutante al interaccionar con el normal lo hace funcionar mal. Típico de productos génicos que funcionan en complejos. Como un alelo nulo, pero de efecto dominante.

46 MUTANTE ANTIMORFO Heterocigoto: produce ambos tipos de receptor
Los heterodímeros no son funcionales: puede haber efecto dominante

47 ¿AYUDA TENER VARIOS ALELOS MUTANTES DEL MISMO GEN?

48 LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS
No todos los alelos son igual de útiles para estudios posteriores: intensificación, supresión, epistasias, etc wt mutantes del mismo gen Distintos alelos Distintos alelos pueden afectar a diferentes actividades del mismo gen Gana fuerza la hipótesis de que el gen está implicado en el desarrollo de esa estructura

49 LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS
Este alelo indica que el mismo gen interviene en el desarrollo del ala y la pata Alelo nulo * Alelo hipomorfo Este alelo indica que afecta más fuertemente al desarrollo del ala que al de la pata * wt Ala Pata

50 LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS
ETAPA I ETAPA II Gen A Antena Gen A Cabeza Alelo nulo de A: no hay cabeza y no se puede llegar a etapa II Detectamos dónde actúa PRIMERO el gen Podemos no detectar dónde lo hace luego

51 LA IMPORTANCIA DE LAS SERIES ALÉLICAS
ETAPA I ETAPA II Gen A Antena Gen A Cabeza Cabeza Alelo hipomorfo de A: problemas en cabeza y antena Podemos detectar los distintos sitios donde actúa el gen

52 ¿TENEMOS MUTANTES DEL MISMO O DE DIFERENTES GENES?

53 ANÁLISIS DE COMPLEMENTACIÓN
m1/m1 x m2/m2 m1 m2 Cruce a realizar: ¿Fenotipo? ¿Afectan las dos mutaciones al mismo gen? (deben ser recesivas) No hay producto funcional del gen FENOTIPO MUTANTE No hay complementación m1 X * m2 SÍ LO HACEN Hay producto funcional de ambos genes FENOTIPO wt Hay complementación wt2 m1 X * m2 wt1 NO LO HACEN

54 BÚSQUEDA DE NUEVOS ALELOS (m) CUANDO YA TENEMOS UNO RECESIVO (a)
Se basa en el análisis de complementación. Mutagenizamos individuos normales porque queremos mutar el alelo silvestre (+). Al cruzarlos con individuos con el alelo ya conocido (a) los pocos descendientes que sigan siendo mutantes lo serán porque portan un nuevo alelo mutante (m) Fenotipo mutante: NO HAY COMPLEMENTACIÓN No se mutó el alelo + +/+ a/a x +/a m/a Nuevo alelo mutante: m Fenotipo wt: HAY COMPLEMENTACIÓN

55 ¿CONTROLAN EL MISMO PROCESO ESTOS VARIOS GENES DE LOS QUE YA TENEMOS MUTANTES?

56 INTERACCIÓN ENTRE GENES
La combinación de mutantes en un mismo individuo da PISTAS sobre cómo interaccionan los productos de los genes afectados Posibles fenotipos de un doble mutante (a/a; b/b): -1) Muestra tanto el fenotipo A como el B Los genes a y b actúan de forma independiente (color de flores y semillas en guisantes de Mendel) -2) Fenotipo wt, o casi wt Uno de los mutantes actúa como SUPRESOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes -3) Fenotipo más fuerte que uno de los de partida (A o B) Uno de los mutantes actúa como INTENSIFICADOR del otro. Puede indicar relación funcional entre los dos genes (parálogos, rutas paralelas …) -4) Muestra el fenotipo A o el B Uno de los mutantes actúa como EPISTÁTICO sobre el otro. Los dos genes actúan en la misma ruta y pueden hacerse hipótesis sobre su orden en ella.

57 ¿PODEMOS OBTENER INTENSIFICADORES Y SUPRESORES INTENCIONADAMENTE?

58 MUTAGÉNESIS DIRIGIDA intensificador enh/enh; a/a wt supresor
posterior mutagénesis inicial wt mutante a/a de interés supresor sup/sup; a/a supresor wt mutante intensificador wt mutante

59 MUTANTES ESPECIALES

60 MUTANTES CONDICIONALES
H E1 E2 E4 E3 mut wt ¿Cuándo se necesita el producto del gen? T permisiva Fenotipo wt T restrictiva mutante Utilidad: Mantener individuos mutantes para un gen esencial Mutagénesis a T restrictiva Cambiar a T permisiva ¿Individuos ahora wt? Individuos mutantes Obtener mutantes condicionales

61 MOSAICOS -/- ¿Dónde o cuándo se necesita la actividad de un gen?
Muere ¿? ¿? ¿? ¿Dónde o cuándo se necesita la actividad de un gen? ¿Qué problemas causa la falta de actividad de un gen en cada sitio o momento? ¿Se necesita su actividad en las células en que se expresa o en otras diferentes?: mutantes autónomos o no autónomos Fen wt Fen. mut No autónomo Fen. wt Autónomo

62 ORGANISMOS MODELO Hay millones de especies vivientes, muchas tendrán interesantes características, pero no hay recursos para estudiar todas en profundidad. Dependiendo del nivel a que se estudien, habrá cosas que tengan en común muchas especies: “Lo que es válido para E. coli debe serlo para los elefantes” (Monod, 1954) Principales características que debe cumplir una buena especie modelo en estudios genéticos y genómicos: Fácil de mantener en el laboratorio e individuos no muy grandes. Produce muchos descendientes en poco tiempo. Fácil obtener e identificar mutantes y hacer cruzamientos entre individuos de forma controlada. Se pueden clonar genes siguiendo protocolos “típicos” así como reintroducirlos en individuos (transgénesis). Se ha determinado la secuencia de su genoma. Especies modelo eucariotas más típicas para estudios genéticos y genómicos:

63 ORGANISMOS MODELO Saccharomyces cerevisae Colonias en 2 días
Mal para señalización Caenorhabditis elegans Ciclo vital 4 dias Transformación dirigida difícil Drosophila melanogaster Ciclo vital en 7-10 días Transformación dirigida difícil Danio rerio Ciclo vital en 90 días Aún no ampliamente usado Mus musculus Ciclo vital en 60 días Problemas de espacio Arabidopsis thaliana Ciclo vital en 42 días Transformación dirigida difícil Zea mays Ciclo vital en días Transformación complicada Oryza sativa Ciclo vital en días Transformación complicada