JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología UPR Aguadilla

Presentación del tema: "JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología UPR Aguadilla"— Transcripción de la presentación:

1 JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología UPR Aguadilla
Extracción DNA Viral JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología UPR Aguadilla

2 Objetivos Al concluir esta practica de laboratorio los estudiantes podrán: Establecer diferencias entre extracción de DNA en bacterias y en virus Explicar el racional para los pasos y reactivos en el proceso de aislamiento de DNA viral Realizar una extracción de DNA viral y visualizarla en una electroforesis de agarosa

3 Introduccion El DNA molécula muy resistente RNA molécula muy lábil
transfiere la información genética de generación en generación

4 Introduccion (cont.) Distintas configuraciones del DNA. Genómico
Cromosomas, genomas Extracromosomal Plásmidos, fagos, mitocondrial

5 Lísis celular Romper la pared, membrana o cápsula Osmótica Enzimática
Buffer, sales, agua Enzimática Lisozimas, proteinasa K Mecánica Nitrogeno Sonicadores Homogenizadores

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7 Amortiguador Buffer pH – TAE Quelantes Detergentes Proteasas Frío
Inactivar enzimas Detener metabolismo

8 Amortiguador Buffer pH – TAE pH iones Buffer TAE TBE Conductividad +++
Sobrecalentamiento Inhibidor de enzimas - Separación fragmentos grandes ++ Separacion fragmentos pequenos Tris – alcalino Acetato – acido pH 8.5

9 Detergente Detergente SDS Cabeza hidrofílica Cola hidrofóbica
Disolver grasas SDS sodium docecyl sulfate

10 Quelante Solución alcalina. Mantener el pH con el amortiguador.
Nucleasas de DNA Cationes divalentes Ca+2, Mg+2 Acido etilendiaminotetraacetico Dos lugares para atrapar metales No estarian disponibles para la enzima Inactivar la enzima Insoluble hasta llegar a 8

11 Extracción Luego de lísis, solución homogénea con mezcla de:
Debris celular Proteínas desnaturalizadas, enzimas Carbohidratos, grasas, Acidos nucleicos Centrifugar Remover debris celular Se queda el ADN en la fase acuosa con las proteínas

12 Extracción - Cloroformo/Fenol
Fenol/Cloroformo Proteínas se precipitan Cloroformo no es soluble en agua. Polar disuelve polar No polar disuelve no polar

13 Purificación: Sales/Isopropanol/Etanol
El DNA y RNA se encuentra ahora en agua (polar) Sales y Alcohol mezcla con el agua mejor que con el DNA PLT: DNA y RNA se salen de solución Centrifugar Resuspender RNAsa3765

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15 Almacenar DNA Estabilidad Buffers: Agua TE Temperaturas 4˚C por un año
70˚C por periodos extendidos

16 Protocolo 1. Comenzar con 500 ul del medio que contiene M13.
2. Añadir 500 ul de fenol/cloroformo/alcohol isoamilico saturado en Tris 3. Mezclar en vortex x 30 segundos 4. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min 5. Transferir fase acuosa (~450ul) a un microtubo. 6. Separar la muestra en 2 microtubos (~200ulc/u)

17 Protocolo 7. Añadir 1/10 parte del volumen de Acetato de Sodio, pH 4.8; (~20ul) 8. Vortex por 30 segundos 9. Añadir 0.7X del volumen de isopropanol 100% frio!!! ~160 ul Puede detenerse aqui y guardarse a -20oC hasta la proxima clase

18 Protocolo 10. Centrifugar a 12,000 rpm por 30 min a 4oC. 11. Invertir cuidadosamente para descartar el sobrenadante prestando atención al pellet. 12. Añadir 1ml de EtOH 70%, vortex 13. Centrifugar a 12,000 rpm a 4oC 14. Invertir cuidadosamente para descartar el sobrenadante prestando atención al pellet. - se puede centrifugar unos 30 segundos mas y remover residuos de etanol con micropipeta sin perturbar el pellet.

19 Protocolo 15. Incubar el microtubo abierto a temperatura ambiente por 15 min, para facilitar evaporación del EtOH. 16. Resuspender el pellet en 25 ul de agua destilada o TE 17. Guardar microtubo bien rotulado a -20oC.