ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida (HPLC) Teoría, Instrumentación, Técnicas de Separación Quim. Jorge L. Rodríguez.

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida (HPLC) Teoría, Instrumentación, Técnicas de Separación Quim. Jorge L. Rodríguez Chero Aplicaciones Químicas Lima, 02 de Julio 2012

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Contenido  Introducción a la Cromatografía  Clasificación de la Cromatografía  Que se puede y que no se puede hacer en Cromatografía  Conceptos Básicos en Cromatografía Líquida  Instrumentación en HPLC  Columnas HPLC  Cuantificación en HPLC  Know How en Separaciones HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Separar Cuantificar Cromatografía es una técnica de separación (tal como la destilación u otras técnicas similares). La Cromatografía separa múltiples tipos de Analitos. Su objetivo es Separar y Cuantificar un compuesto de una mezcla. Que es Cromatografía? Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 (a)(b)(c) Solvente de Elución Inicial Solvente de Elución Final Fracciones secuencialmente colectadas Nro. Fracciones o Volumen Efluente Concentración Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 La Cromatografía, es un método físico de separación donde el soluto se distribuye entre dos fases: Fase Móvil y la Fase Estacionaria. FASE MOVIL Es un líquido (solvente orgánico o agua), el cual puede estar Puro o en Mezcla). Para que un solvente pueda usarse como fase móvil (o parte de ella), debe de presentar características especiales: Transparencia UV y Cut Off Miscibilidad Viscosidad Pureza Estabilidad Fuerza de Elución Seguridad Compresibilidad Índice de Refracción Costo Cut Off Absorbancia Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Solventes HPLC Propiedades Peso Mol. Densid. (20 C) Viscosidad (cP) Fuerza Eluyente (NP) Pol. del Solvente Indi. de Refracción (20 °C) UV Cut Off (nm) Número de Miscib. D<15=Misc Moment. Dipolar Pto de Congel. (°C) Punto de Ebull. (°C) Pto. de Ignición (°C) 1,2-Dicloroetano98.961.25210.780.443.51.442230 --35.78313 2,2,4-Trimetilpentano (= Iso Octano) 114.230.69190.470.010.11.38920029--107.499-12 Acido Acético 1.1 61.37235 118 Acetona58.080.790.320.565.11.35933015, 172.88-94.756-18 Acetonitrilo41.050.78220.340.655.81.34421011,173.92-43.8826 Disulfuro de Carbono 0.340.150.31.626380 46 Tetracloruro de Carbono 0.90.181.61.457265 77 Clorobenceno 0.80.32.71.525 21 132 Cloroformo119.381.48910.570.44.11.443245191.04-63.561N/A Ciclohexano84.160.77860.90.04-0.21.42720028-6.781-17 Ciclopentano 0.420.05-0.21.406200 -103.549-20 Diclorometano (= Cloruro de Metileno) 84.931.32560.410.423.11.424240201.6-94.940N/A Eter Dietilico74.120.71360.240.382.81.352220231.15-116.334-45 Dimetilformamida73.090.94870.80.646.41.43275123.82-60.415358 Dimetilsulfoxido78.131.100420.757.21.47927593.9618.518995 Dioxano Etanol46.070.78921.080.884.31.361220121.69-114.57812 Acetato de Etilo88.110.90060.450.584.41.372260191.78-83.677-4 Fluoroalcanos -0.25<-21.25 Principales Solventes y sus Propiedades Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Solventes HPLC Propiedades Peso Molecular Densidad (20 °C) Viscosidad (cP) Fuerza Eluyente (NP) Polaridad del Solvente Indice de Refracción (20 °C) UV Cut Off (nm) Número de Miscibilidad D<15=Misc Momento Dipolar Punto de Congelam. (°C) Punto de Ebull. (°C) Punto de Ignición (°C) Heptano100.20.68380.40.010.21.388195290-90.698-4 Hexano86.180.65930.290.010.11.37519029--95.369-23 Metanol32.040.7910.540.955.11.328210121.7-97.76510 Metil Etil Cetona (MEC)72.110.80490.380.514.71.376330172.78-86.780-7 m-Xileno106.170.86440.620.262.51.497290 -139.113925 Acetato de n-Butilo 0.730.441.39425422 126 n-Butil Eter 0.640.252.11.397220 Nitrometano 0.670.6461.38380 101 N-Metil Pirolidona 1.670.76.71.468285 202 Pentano72.150.62620.22001.355195 --129.736-48 Eter de Petroleo 0.30.010.11.3921029 n-Propanol60.10.80361.90.841.386240 1.55-126.29715 2-Propanol (IPA)60.10.78551.90.823.91.384210151.56-888212 Piridina79.10.98320.880.715.31.51305162.21-41.611520 Tetrahidrofurano (THF)72.110.88920.460.641.407215171.75-108.466-17 Tolueno92.140.86680.550.292.41.497285230.37-951114.4 Trietilamina 0.360.541.91.398275 89 Agua18.020.99821High10.21.333<190 1.850100N/A Principales Solventes y sus Propiedades Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 17 Introducción a la Cromatografía Resolución (R) Factores que Afectan la Resolución: N: Incrementar la Longitud de la Columna. : Disminuir el Tamaño de Partícula : Optimizar el Flujo k’: Incrementar (Solvente Débil) : Disminuir (Solvente Fuerte) α: Cambiar Fase Estacionaria : Cambiar Fase Móvil : Cambiar Buffer pH : Temperatura

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Conceptos y Principios La cromatografía es, en sí, una técnica de separación y no una técnica analítica, pero se puede usar para ambos propósitos, por eso, también podemos clasificar a la cromatografía de la siguiente manera: Cromatografía Preparativa Cromatografía Preparativa (Separación y Purificación). Cromatografía Analítica Cromatografía Analítica (Separación y Cuantificación). Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida fase móvillíquido La cromatografía líquida, es aquel en el cual la fase móvil se encuentra en estado líquido. En la cual se puede separar cualquier compuesto orgánico, inclusive iones. (con respecto a cromatografía de gases). Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida Ventajas de la Cromatografía como Técnica Analítica  Análisis Simultáneos  Alta resolución  Alta sensibilidad (ppm-ppb-ppt)  Volumen de Inyección pequeño (10-100 μL) Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatógrafo Líquido (HPLC) Componentes de un Cromatógrafo Líquido (HPLC) Recipiente de Solventes. Desgasificador. Bomba. Inyector (Auto Muestreador). Horno de Columna. Detector. Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatógrafo Líquido (HPLC) Injector Detector Column Solvents Mixer Pumps Chromatogram Start Injection mAU time High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) Introducción a la Cromatografía

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Controlador de Sistema CBM-20A Los controladores CBM-20A/20Alite son módulos “bus” de comunicaciones con capacidad de almacenamiento temporario de datos (data buffering). El CBM-20A es un controlador tipo caja que puede controlar hasta 8 unidades. El CBM-20Alite es un controlador tipo tarjeta diseñado para simplicidad, Se instala en una unidad de bombeo de solventes LC-20AD/20AT/20AB o en un muestreador automático SIL- 20A/20AC y puede controlar hasta 5 unidades, incluyendo la unidad donde es instalado. Estos controladores de sistema sirven de interfase entre cada unidad y la PC. CBM-20ACBM-20A Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Desgasificador Se encarga de eliminar a todos los gases que se encuentran disueltos en los solventes que son las fases móviles. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Bombas Las bombas son dispositivos capaces de proporcionar a la fase móvil la presión necesaria para que operando al flujo o velocidad precisa, atraviese la columna cromatográfica. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Las bombas se pueden clasificar de la siguiente manera: De presión constante : De presión constante : Presión directa mediante un gas. Intensificador neumático. Intensificador hidráulico. De flujo constante : De flujo constante : De Pistón. De Pistón recíprocas. De Jeringa. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Sistema de Inyección de Muestra Se encarga de introducir la muestra en el cromatógrafo, y mantener la presión del sistema, y poner a la muestra al mismo flujo que se encuentra la fase móvil. Se clasifican en: Inyección Manual. Inyección Manual. Inyección Automática. Inyección Automática. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Sistema de Inyección Automático. Sistema de Inyección Automático. Dada la naturaleza separativa y analítica de la técnica de HPLC, estos sistemas son muy empleados en los campos de clínica e industria, donde se requiere analizar gran número de muestras. Dada la naturaleza separativa y analítica de la técnica de HPLC, estos sistemas son muy empleados en los campos de clínica e industria, donde se requiere analizar gran número de muestras. Alta precisión al momento de inyectar la muestra.Alta precisión al momento de inyectar la muestra. Facilidad de elaboración de curvas de calibración.Facilidad de elaboración de curvas de calibración. Alta precisión al momento de inyectar la muestra.Alta precisión al momento de inyectar la muestra. Facilidad de elaboración de curvas de calibración.Facilidad de elaboración de curvas de calibración. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Horno de la Columna Espacio donde se coloca la columna cromatográfica. La columna es sometida a una variación de temperatura para mejorar la separación. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Detector Se encarga de dar una señal, al momento de que inicia la elución de un componente que ha sido separado por la columna cromatográfica. Detector UV-VIS Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Los detectores se pueden clasificar de la siguiente manera: Detectores Universales : Detectores Universales : Se basan en detectar cambios en una propiedad física, para todo tipo de moléculas. Detectores Selectivos : Detectores Selectivos : Son opuestos a los anteriores, detectan una limitada serie de compuestos. Detectores Específicos : Detectores Específicos : Sólo pueden responder a un muy limitado grupo de moléculas. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Procesador de Datos o Software Procesa los datos obtenidos (cromatográmas) para análisis cualitativo y cuantitativo. Sirve además para realizar ajuste a los métodos. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Columnas en HPLC Las columnas cromatográficas son las responsables de la separación de una mezcla, en ella se encuentra la fase estacionaria. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Características generales de las columnas en HPLC Longitud de columna: 4 a 30 cm. Diámetro Interno (i.d.): 2 a 20 mm. Tamaño de partícula de rellenos: 3 a 50 µm. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Fases Estacionarias La fase estacionaria, principalmente, define el tipo de cromatografía líquida, se dividen principalmente en dos: Fases Normal Fases Reversa Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Fase reversa: Fase reversa: Interacción Hidrofóbica de grupos Butilos y Anillo Fenilo, con Fase C18 Interacción Hidrofóbica de grupos Butilos y Anillo Fenilo, con Fase C18 Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida HPLC Efecto de Fase Móvil en las Interacciones de analitos, con la Fase Estacionaria Efecto de Fase Móvil en las Interacciones de analitos, con la Fase Estacionaria

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía de Fase unida Químicamente La fase estacionaria se une químicamente a la superficie de la partícula soporte. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Elución Isocrática. Cuando la composición de la fase móvil, se mantiene constante, durante toda la corrida cromatográfica. Se denomina Elución Isocrática. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Elución con Gradiente. Cuando la composición de la fase móvil, varía proporcionalmente, durante la corrida cromatográfica. Se denomina Elución con Gradiente. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Análisis Cualitativo y Cuantitativo Análisis Cualitativo. Análisis Cualitativo. Cuando un análisis es realizado bajo las mismas condiciones analíticas, los mismos compuestos eluyen seguramente al mismo tiempo. Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Método del Estándar Externo Estandar 1uL （ Componente A 100ppm ） Componente A Muestra Problema 1uL Componente A Peak area : 700 Peak area : 1000 100 Concentration (ppm) 1000 Peak area 700 70 Concentracion del componente A es 70ppm Cromatografía Líquida HPLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Disminuye el tiempo de análisis. Mejora el análisis estructural en LC-MS. Mejorar el desenvolvimiento de métodos analíticos Reduce el costo por corrida (Economía de Solvente 1/5 – 1/10) HPLC - UFLC Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC Flujo: 0,2 mL/min Tamaño de partícula y separación Separación rápida con resolución, empleando partículas menores Flujo: 0,7 mL/min A 0,2 mL/min (Flujo Convencional) A 0,7 mL/min (Flujo Elevado) Separación de Parabenos

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC Alta Velocidad Desenvolvimiento de la Columna Reducción del tiempo de análisis – Partículas de 2,5 µm o menores Facilidad Operacional Sistemas de HPLC – Partículas de 2,5 µm o mayores

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC Reducción de la presión Temperatura Elevada Presión de Columna / Relación con la temperatura La eficiencia de la columna no es reducida a tasas de flujo más elevadas Curva de van Deemter

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC Efecto de la Elevación de la Temperatura Mejor Eficiencia de la Columna: Aumento de N y Reducción de la presión

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 95 Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC Prominence UFLC: Alta Velocidad, superior reproducibilidad, y comprensiva Expandibilidad 0.03.06.09.012.015.0 min. HPLC 0.00.51.01.52.5 min.2.0 UFLC Prominence UFLC: Reduce grandemente el tiempo de análisis sin sacrificar la separación Prominence UFLC XR :Obtiene gran separación mientras mantiene una velocidad ultra alta. De HPLC a UFLC

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC Shimadzu Prominence UFLC XR Alta Velocidad y Alta Resolución Tolerancia de Presión Hasta 66 MPa (9570 psi, 660 bar) Optimizado para menor dispersión Tubulación, Sello de aguja, Auto - Inyector Amplia Aplicación Uso de Columnas Largas Alta resolución con Columnas Shim-pack XR-ODS II Partículas con 2,2 µm de diámetro y 8 nm de poro Análisis Ultra – Rápidos con MeOH como fáse móvil

ELECTROMEDICA PERUANA S.A. Derechos Reservados 2012 Peaks; 1: Acetophenone 2: Propiophenone 3: Butyrophenone 4: Valerophenone 5: Hexanophenone 6: Heptanophenone 7: Octanophenone 0.02.55.07.510.0 12.5 min 0 25 50 75 100 125 2 3 4 5 6 7 VP-ODS (4.6 mm  150 mm, 5mm) Flow rate : 1.0 mL/min 1 1 2 3 4 5 6 7 0.00.51.01.52.02.5 3.0 0 25 50 75 100 125 150 mAU min 0 50 100 150 200 250 mAU 1 2 3 4 5 6 7 N:14800 XR-ODS (3.0mm  75 mm, 2.2mm) Flow rate : 1.2 mL/min N:14200 0.000.250.500.751.001.25 1.50 1.752.00 2.25 2.50min XR-ODS II (3.0mm  150 mm, 2.2mm) Flow rate : 1.3 mL/min N:28100 Increased speed Increased separation performance HPLC UFLC UFLC XR Cromatografía Líquida de Alta Presión UFLC UFLC XR

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