Transferência de DNA entre procariotos. 3 mecanismos de transferência de DNA em procariotos: 1.Transformação 2.Conjugação 3.Transdução Quando um procarioto.

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1 Transferência de DNA entre procariotos

2 3 mecanismos de transferência de DNA em procariotos: 1.Transformação 2.Conjugação 3.Transdução Quando um procarioto recebe um fragmento de material genético ele forma um merozigoto transitório, sendo a célula receptora chamada de endogenoto e a doadora de exogenoto. Transferência de DNA entre procariotos

3 3 mecanismos de transferência de DNA em procariotos: 1.Transformação 2.Conjugação 3.Transdução Transferência de DNA entre procariotos

4 Transformação Realizada por algumas bactérias e arquéas Histórico Frederick Griffith, 1928: Streptococcus pneumoniae Avery, MacLeod e McCarty, 1944: o princípio transformante tratava-se de DNA. Transformação é o mecanismo de transferência de genes através do qual um segmento de segmento de DNA livre no meio, oriundo de uma célula doadora geralmente morta e lisada, implanta-se no genoma da célula receptora.

5 Célula competente: capaz de captar DNA exógeno por transformação. Estado de competência: estado da célula durante o processo de transformação. Transitório e de curta duração, geralmente a partir do o meio para o final da fase log de crescimento. Etapas básicas da transformação Transformação

6 Gram-positivas X Gram-negativas Transformação

7 Etapa 1: desenvolvimento do estado de competência Final da fase log de crescimento Streptococcus, Haemophilus, Neisseria  todas as células se tornam competentes Bacillus e Acinetobacter  10-25% da população se torna competente Mudanças no envelope celular com o aparecimento de proteínas envolvidas na ligação e captura do DNA, além da formação de estruturas para a passagem desse DNA pela parede e membrana. Mecanismos altamente regulado. Em alguns microrganismos pode ser induzido por certos tipos moleculares. Transformação

8 Competência em bactérias Gram-positivas Modelo: Streptococcus pneumoniae, S. sanguis, B. subtilis Secreção de fator de competência ou ativador. Em Bacillus o fator de competência também é chamado de ferormônio de competência. Competência em bactérias Gram-negativas Não tem fator de competência identificado Transformação Fator de competência Cromossomo Síntese de proteínas características do estado de competência

9 DNA livre proveniente de células mortas e lisadas ou excretado por células viáveis se adere à superfície de células competentes. Como o Dna está livre no meio, este é um processo sensível a presença de DNAses Transformação Etapa 2: adsorção do DNA às células receptoras DNA geralmente de fita dupla

10 DNA fita dupla. Bacillus e Haemophilus também podem capturar DNA fita simples em meio ácido. A célula receptora tem vários sítios (4-50) de ligação do DNA. Este sítio é formado por proteínas, entre elas a ComEA que reconhece o DNA exógeno. Após a ligação, o DNA fd é fragmentando a segmentos de 6-15 kb por uma endonuclease associada a membrana. Algumas bactérias (Haemophilus, Neisseria) captam DNA proveniente de bactérias da mesma espécie (necessidade de seqüências específicas) enquanto outras (Streptococcus, Bacillus) captam DNA de diferentes origens. A adsorção do DNA é irreversível. Transformação

11 Etapa 3: penetração do DNA exógeno nas células receptoras Requer cátions (Mg 2+, Ca 2+ ou Na + ) Uma fita atravessa o envoltório celular, geralmente a partir do terminal 3’ e a outra fita é degradada Transformação

12 O DNA passa para uma forma resistente a DNAases através da associação com uma proteína básica formando o complexo de eclipse. A proteína de eclipse também mantém as bases não pareadas secretinas Transformação Gram-positivas Gram-negativas Proteína de eclipse R = proteínas receptoras N = nuclease T = proteínas de transporte

13 Etapa 4: integração do DNA exógeno Transformação Recombinação Uma região do endogenoto é substituída por um segmento do exogenoto. Célula transformante

14 Transformação O DNA exógeno precisa recombinar com o DNA da célula receptora para que possa ter seus genes expressos. Necessidade e homologia entre o DNA exógeno e algum segmento do DNA da célula hospedeira.

15 Transformação

16 Como o processo de integração do DNA se dá por recombinação, a transformação é mais freqüente com DNA exógeno de bactérias da mesma espécie ou de espécies evolutivamente relacionadas. Somente um pequeno número de espécies de procariotos é capaz de sofrer transformação na natureza. Como o DNA sofre fragmentação e degradação de uma das fitas, a recombinação de DNA de origem plasmidial não é eficiente, logo a transformação de plasmídeo também não é eficiente. A transformação pode ter realizada in Vitro através de métodos como: Eletroporação Via protoplastos Via esferoplastos Via choque térmico Biobalística Transformação

17 3 mecanismos de transferência de DNA em procariotos: 1.Transformação 2.Conjugação 3.Transdução Transferência de DNA entre procariotos

18 Conjugação Conjugação é um processo altamente específico através do qual DNA é transferido de uma célula doadora para uma célula receptora por um complexo multiprotéico denominado de aparato de conjugação. É necessário que as duas células estejam em contato íntimo para que a conjugação ocorra.

19 Histórico Lederberg e Tatum, 1947 Conjugação O evento não podia ser transformação por que a presença de DNAase no meio não impedia o aparecimento de celular recombinantes.

20 Ocorre em bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e arquéas. Necessidade da presença de plasmídeo conjugativo na célula doadora, ex. plasmídeo F (fertilidade). O plasmídeo conjugativo codifica moléculas e estruturas envolvidas no contato celular. Plasmídeo conjugativo de bactérias Gram-negativas : conjugação em meio sólido e líquido. Plasmídeo conjugativo de bactérias Gram-positivas: alguns promovem a conjugação em meio sólido (baixa freqüência de conjugação) outros em meio sólido e líquido (alta freqüência de conjugação). Tamanho: ≥25 kb Genes tra e trb: envolvidos no processo de conjugação Conjugação

21 Plasmídeo F (100kb) Origem de transferência Elementos de inserção Região onde estão os genes envolvidos na conjugação

22 Etapas gerais da conjugação Conjugação Estabelecimento de contato celular Transferência de DNA

23 Etapa 1: contato entre a célula doadora e a célula receptora Conjugação

24 Gram-negativas A célula doadora é aquela que possui o plasmídeo conjugativo e apresenta 1 ou 2 pili sexuais. Conjugação Pilus sexual codificado pelo plasmídeo conjugativo, reconhece especificamente a célula receptora. Cilindro oco composto pela proteína pilina. Interação entre células doadora-receptora: Específico; Estabelece o par; Transmite sinais para a ativação do metabolismo envolvido na conjugação.

25 Conjugação Gram-negativas Contato parede-parede e formação de poro entre as superfícies celulares. Possível participação da porina OmpA

26 Conjugação Gram-positivas Plasmídeos que respondem à ferormônios sexuais Ferormônios sexuais: pequenos peptídeos hidrofóbicos, termoestáveis e sensíveis a proteases produzidos pelas células receptoras. Cada plasmídeo conjugativo responde a um ferormônio. Após ligar ao receptor específico codificado pelo plasmídeo, o ferormônio é internalizado e induz a síntese a substância de agregação pelas células doadoras. A substância de agregação atua na formação de contato celular, não na formação de canal intermembrana.

27 Conjugação Gram-positivas Cada ferormônio é específico para uma família de plasmídeos. O receptor específico é codificado pelo plasmídeo conjugativo. A substância de agregação também é codificada pelo plasmídeo conjugativo. Substância de ligação codificada pelo cromossomo. O ácido lipoteicóico faz parte da substância de ligação. Modelo: Enterococcus faecalis e E. faecium

28 Etapa 2: Transferência de DNA 1.Aparecimento do complexo de formação de pares (mdf), que formam um canal entre as membranas e está envolvida na transferência do DNA. Formação do relaxossomo, um complexo proteico que se liga a uma região específica do plasmídeo conjugativo, a região oriT. Clivagem de uma das fitas do DNA do plasmídeo, no sítio nic da região oriT pela endonuclease relaxase (codificada pelo plasmídeo). Conjugação

29 2. O terminal 5’ ligada a relaxase é transferida para a célula receptora. Conjugação mdf: complexo de formação de pares relaxase genes tra e trb: últimos a serem transferidos

30 3. A relaxase permanece ligada ao terminal 5’P, na região intermembranas. 4. Paralelamente ocorre a separação das fitas de DNA do plasmídeo por uma proteína com função de helicase. 5. A fita que permanece na célula doadora e a fita transferida são duplicadas durante o processo. Conjugação

31 6. Ao final do processo os terminas do plasmídeo são ligados pela relaxase. As últimas regiões do DNA plasmidial a serem transferidas são as que contém os genes tra e trb, que codificam as funções relacionadas á conjugação. A célula receptora que sofre conjugação é chamada de transconjugante ou exconjugante. Os plasmídeos conjugativos carreiam determinantes genéticos variados, a conferem características adicionais. Conjugação

32 DNA cromossômico pode ser transferido por conjugação. A integração do plasmídeo conjugativo ao cromossomo se dá por recombinação e depende de regiões homólogas, como IS3. A linhagem que possui o plasmídeo conjugativo integrado ao cromossomo é chamado de Hfr (high-frequency recombination ). Apenas um pedaço do cromossomo é transferido. Conjugação

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34 Ocorrência Em Gram-negativas: dependendo do plasmídeos, pode ocorrer entre bactérias da mesma espécie, entre espécies diferentes, entre gêneros diferentes (plasmídeos promíscuos). Em Gram-positivas: para plasmídeos que se transferem em meio sólido, a conjugação pode ocorrer entre bactérias da mesma espécie, entre espécies diferentes, entre gêneros diferentes. Plasmídeos que respondem a ferormônios ocorrem entre estirpes de Enterococcus faecalis e E. faecium. Em arquéas: detectada em halófilas e hipertermófilas não metanogênicas. Em ambientes naturais e in vitro. Conjugação

35 Transpósons conjugativos Conjugação mediada pela a presença de transpósons conjugativos na célula doadora. Principalmente em bactérias Gram-positivas (Enterococcus, Streptococcus). O transpóson conjugativo está presente geralmente no cromossomo, podendo ser encontrado com menor frequência em plasmídeos com baixo número de cópias. Disseminação de resistência a drogas. Processo necessita de contato celular. Podem possuir as seqüências terminais imperfeitas; Não levam á duplicação do sítio ativo; Codificam os genes necessários para o contato celular e a transferência de DNA, como relaxase e genes tra, além de possuir oriT. São maiores que os transpósons comuns. A transferência pode ocorrer entre bactérias da mesma espécie, entre espécies diferentes, entre gêneros diferentes Conjugação

36 Etapas da conjugação por transpósons conjugativos 1.Excisão do Tn mediada pelas proteína Xis (excisionase) e Int (integrase) 2.Formação de intermediário circular, contendo o sítio de integração 3.Contado celular (processo desconhecido) 4.Transferência do Tn por um processo que pode ser semelhante ao dos plasmídeos conjugativos 5.Inserção do Tn preferencialmente no cromossomo (Int) Conjugação Sítio de integração, resultante da recombinação dos sítios que flanqueiam o Tn

37 Conjugação Transferência por conjugação de plasmídeos não conjugativos Não possuem o aparato para a conjugação, mas podem ser transferidos por conjugação. São de dois tipos: Plasmídeos não conjugativos mobilizáveis: Região oriT Genes mob (mobA  relaxase; mob C  helicase). Se eles estiverem em uma célula que tenha plasmídeos conjugativo ou transpóson conjugativo, eles podem se aproveitar do aparato de conjugação. DOAÇÃO

38 Plasmídeos não-conjugativos e não-mobilizáveis Não possui oriT, nem codifica relaxase ou aparato de conjugação. Podem ser transferidos por conjugação desde que a célula tenha um plasmídeo os transpóson conjugativos. Depende da transposição do Tn conjugativo presente nele ou da recombinação aditiva entre o plasmídeo conjugativo e o não conjugativo (ambos eventos raros). CONDUÇÃO Conjugação

39 3 mecanismos de transferência de DNA em procariotos: 1.Transformação 2.Conjugação 3.Transdução Transferência de DNA entre procariotos

40 Transdução é o mecanismo de transferência de genes entre bactérias mediado por bacteriófagos (ou fagos), que são vírus que infectam bactérias. Transdução Lederberg e Zinder, 1952, Salmonella typhimurium Não podia ser conjugação, pois o filtro impossibilitava o contato entre as linhagens. Não podia ter transformação por que havia DNAase no meio.

41 Partícula fágica Transdução DNA fd Cilindro oco que pode ser envolvido por uma bainha contrátil Nem todas estas estruturas estão presentes nos fagos Fagos virulentos: geralmente lisam a célula e degradam totalmente o cromossomo bacteriano. Fago temperado: a infecção pode levar ao ciclo lítico ou a integração do genoma do fago ao cromossomo bacteriano. Os fagos temperados não causam extensa degradação do cromossomo da bactéria. MEV bacteriófago

42 Transdução

43 Ciclo biológico de um fago temperado 1.Adsorção do fago à uma célula sensível Presença de receptores específicos na superfície bacteriana (LPS, proteínas de transporte, ácido teicóico ou lipoteicóico) 2. Penetração da molécula de DNA do fago na bactéria Contração da bainha que empurra a calda. Ou formação de poro por proteínas fágicas. Transdução

44 3. Circularização do DNA do fago O processo varia de acordo com o fago. Ex.: Transdução

45 4. Ciclo lítico ou ciclo lisogênico Transdução Mediado pela integrase do fago profago Células lisogêncas A montagem do vírus é chamada maturação ou morfogênese

46 Transdução Transdução generalizada É o tipo mais comum de transdução. Uma em cada10 6 partículas virais formadas empacotam DNA bacteriano. O fago transdutor contém apenas DNA de origem bacteriana. O tamanho do DNA transportado depende do tamanho da cabeça do fago. Se o fago carregar plasmídeos de tamanhos pequenos, estes irão em várias cópias formando um concatenado.

47 Se o fago injetar um plasmídeo na célula receptora, este deverá ser capaz de se duplicar na célula para ser considerado estável. Se o fago transdutor injetar um fragmento de cromossomo, para que este se estabeleça, deve recombinar com o endogenoto. Transdução Célula bacteriana que sofre transdução é chamada de transdutante.

48 Transdução especializada Para fagos que empacotam, junto com DNA bacteriano, uma seqüência específica de DNA do fago. Ocorre em células lisogênicas para fagos que se integram em um único ponto do cromossomo. Quando o fago se solta, ele carrega um segmento do DNA bacteriano e deixa um pedaço do DNA fágico. Molécula de DNA mista. Carrega genes próximos ao local de inserção do DNA do fago. O exogenoto deve recombinar com o endogenoto para que os transdutantes sejam estáveis. Transdução

49 Ocorrência: Geralmente entre bactérias da mesma espécie, já que os fagos são espécie-específicos. Poucos fagos (ex.: P1) é capaz de infectar bactérias de gêneros diferentes Gram-positiva, Gram-negativas, e em arquéas observado apenas em Methabacterium thermoautotrophicum. Ocorre em todos os ambientes onde as bactérias são encontradas. Transdução

50 CaracterísticaBacteriaArchaeaEukarya Tipo de cromossomo Circular Linear N° de cromossomos Um Múltiplos PlasmídeosEm algumas células, geralmente mais de 1 por célula Em algumas célulasEm alguns fungos e protozoários Localização do cromossomo No citosol No núcleo Histonas? NãoSim Elementos transponíveis Sim Diferenças entre os três domínios