PCR Por: Karla Rocio Gurrola Rodriguez 1. R EACCIÓN EN C ADENA DE LA P OLIMERASA Se usa para amplificar una secuencia de DNA 1983 (Rodríguez I y cols.,

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1 PCR Por: Karla Rocio Gurrola Rodriguez 1

2 R EACCIÓN EN C ADENA DE LA P OLIMERASA Se usa para amplificar una secuencia de DNA 1983 (Rodríguez I y cols., 2004;Torres A y cols., 1995) Con ésta se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de interés representa tan sólo una diezmillonésima parte. 2

3 Desoxinucleosidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores (o primers ), oligonucleotidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2). Iones monovalentes, como el potasio. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa). ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. E LEMENTOS NECESARIOS PARA LA PCR 3

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5 TERMOCICLADOR 30 ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos. Consisten en un bloque que puede ser programado para calentarse y enfriarse rápidamente en determinados tiempos ¿E N DONDE SE LLEVA A CABO LA REACCIÓN ? 5

6 (Lodish y cols., 2006) 6

7 E TAPAS  Desnaturalización  Alineamiento/Unión del cebador  Extensión/Elongación de la cadena  Elongación Final 7

8 Mediante un calentamiento a 94°C, el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen Actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC (vida media a 92.5ºC = 2h, a 95ºC = 40 min. y a 97.5ºC = 5 min.), por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación. Se rompen puentes de hidrogeno. Las bases nitrogenadas quedan expuestas Síntesis de novo. D ESNATURALIZACIÓN (Rodríguez I y cols., 2004) 8

9 ETAPAS  Desnaturalización  Alineamiento/Unión del cebador  Extensión/Elongación de la cadena  Elongación Final Se añaden los nucleótidos en el hidroxilo 3´ terminal del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificación. Mientras que un cebador es complementario al extremo 5´ de la región del ADN molde a amplificar, el otro es al extremo 3´de la misma pero en la cadena opuesta (Torres A y cols., 1995) A LINEAMIENTO /U NIÓN DEL CEBADOR 9

10 Inicio de la reacción de la PCR. Los cebadores complementarios que flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de hidrógeno. De esta manera la polimerasa puede comenzar a extenderlos para copiar ambas hebras molde. ETAPAS  Desnaturalización  Alineamiento/Unión del cebador  Extensión/Elongación de la cadena  Elongación Final A LINEAMIENTO /U NIÓN DEL CEBADOR Enzima Taq polimerasa Temperatura entre 40 y 72º C 10

11 ETAPAS  Desnaturalización  Alineamiento/Unión del cebador  Extensión/Elongación de la cadena  Elongación Final Desoxiribonucleosidos monofosfatos 1 min. Para alargar 1000 nucleótidos Progreso de la reacción de la PCR. A la temperatura óptima de la ADN Polimerasa Taq (72°C), la enzima agrega los dNTPs a partir del 5 prima hacia el extremo 3 prima (Rodríguez I y cols., 2004) EXTENCIÓN / ELONGACIÓN DE LA CADENA 11

12 Es común que al finalizar todos los ciclos se realice un último alargamiento por 5 min. a 72ºC, para asegurarse que todos los productos de amplificación estén completamente terminados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud ETAPAS  Desnaturalización  Alineamiento/Unión del cebador  Extensión/Elongación de la cadena  Elongación Final (Rodríguez I y cols., 2004) 12

13 PCR Melting 94 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 5’3’ 5’ DNA de cadena doble

14 PCR Melting 94 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 3’5’ 3’ Calor DNA de cadena simple

15 PCR Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 3’5’ 3’ 5’ Melting 94 o C Hibridación de primers

16 PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 30 ciclos 3’5’ 3’ Calor 5’

17 PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’5’ 3’ 5’

18 PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’5’ 3’ 5’ Calor

19 PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’5’ 3’ 5’

20 Fragmentos de tamaño definido PCR Melting 94 o C Melting 94 o C Annealing Primers 50 o C Extension 72 o C Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’5’ 3’ 5’

21 RETRO PCR PCR INVERSA PCR INTERNA PCR ASIMETRICA PCR IN SITU PCR MULTIPLE PCR ARBITRARIA 21 PCR Y SUS VARIANTES

22  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA 22  El molde utilizado es RNA pero el producto final es ADN  Generación de cDNA  Enzima retrotranscriptasa reversa (Castillo F y Roldan M., 2005)

23 23 Es muy conveniente para conocer la fisiología de las células y saber cómo cambia la expresión de genes (su traducción a proteinas) a lo largo de un procesos infeccioso.  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA (Alberts B y cols., 2006)

24 24  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA Permite realizar una amplificación de las regiones flanqueantes de un fragmento de ADN que solo se conoce su secuencia interna secuencia conocida secuencias desconocidas +ER ER digerir DNA ligar extremos PCR 30 ciclos de PCR www.revistanefrologia.com/revistas/P7-E121/P7-E121-S140-A2571.pdf (Castillo F y Roldan M., 2005)

25 25  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA Pequeñas cantidades de DNA Se quieren evitar las amplificaciones inespecíficas que a veces se observan con la PCR tradicional, dado que en cada etapa se realizan un numero menor de ciclos. Se usan iniciadores cuya secuencia está hacia dentro del producto de la secuencia original (anidados) Se genera un producto más pequeño que el de la reacción primaria PCR anidado ó nested PCR CYP2D6 CYP2D7 CYP2D8 (Salazar H, 2007)

26 26  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios a concentraciones molares distintas en una relación entre 50/1 y 100/1. Se produce ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador minoritario y luego sólo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra en exceso, produciéndose a partir de entonces de forma lineal. El producto de PCR contiene 10 a 20 veces más de ADN monocatenario que de ADN bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para una secuenciación directa con la técnica de Sanger

27 27  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA Realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/ hibridacion_in_situ.pdf

28 PCR MULTIPLE 28  RETRO PCR  PCR INVERSA  PCR INTERNA  PCR ASIMETRICA  PCR IN SITU  PCR MULTIPLE  PCR ARBITRARIA PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de DNA. (Mas J., 2004)

29 VENTAJAS Técnica específica, sino también muy sensible, pues en principio para practicarla bastaría una sola molécula, por ejemplo, del genoma humano ~6 picogramos. Puede usar como substrato para la reacción al ADN, sin tener que purificarlo de su fuente natural, y es común emplear productos biológicos diversos. Muchas veces basta una simple ebullición de la muestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN, dejándolo listo para la reacción. (Rodríguez I y cols., 2004) 29

30 Se puede prescindir del uso de radioisótopos, los cuales eran indispensables antes de su invencion (Rodríguez I, 2004) Proporciona muchas alternativas más rápidas y menos costosas para muchas aplicaciones de la clonación, en particular para los organismos en los que se conoce la secuencia completa del genoma. Puede producirse enteramente in vitro, sin el uso de células. Con está técnica se puede seleccionar una secuencia especifica de nucleótidos para replicarse en forma selectiva y rápida en grandes cantidades a partir de cualquier muestra que las contenga (Alberts y cols., 2006). 30

31 DESVENTAJAS Debido a que los cebadores tienen que sintetizarse químicamente, la PCR solo puede utilizarse solo para clonar ADN con secuencias de comienzo y de terminación conocidas.

32 APLICACIONES PREDIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES AMPLIFICACIÓN DE REGIONES HIPERVARIABLES INVESTIGACIONES FORENSES APLICACIONES EN ESTUDIOS EVOLUTIVOS

33 DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

34 INVESTIGACIONES FORENSES

35 Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos. El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. APLICACIONES EN ESTUDIOS EVOLUTIVOS

36  Biotecnologia Ambiental de Francisco Castillo Rodriguez y Maria Dolores Roldan Ruiz (Editorial Tebar 2005)  Salazar Henry, 2007 http://www.scribd.com/doc/20900217/PCR  Pierce B. Genética. Panamericana Ed. 2da. España 2005  Lodish, Berk, Matsudaria, Kaiser, Krieger, Scott, Aipursky, Darnell. Biología Celular y Molecular. Panamericana Ed. 5ta. Madrid 2005.  Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts. Introducción a la Biología Celular. Panamericana 2006  Mas Oliva Jaime. Diagnóstico molecular en medicina. Manual Moderno. México D.F.2004.  DERMATOLOGÍA PERUANA - VOL. 9, SUPLEMENTO 1, DICIEMBRE - 1999 36 BIBLIOGRAFIA

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