Espectroscopia de Absorción Molecular UV-Visible Profesora: Yosmery Vitta. Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias Escuela de Química.

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1 Espectroscopia de Absorción Molecular UV-Visible Profesora: Yosmery Vitta. Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias Escuela de Química

2 Fundamento La Espectroscopia de Absorción Molecular, se basa en la medida de la absorbancia o transmitancia, por una disolución que se encuentra dentro de una cubeta transparente que tienen un camino óptico de b cm. Haz incidente, Po Haz emergente, P Perdidas por reflexión en la interfase Perdidas por dispersión en la disolución Perdidas por reflexión en las interfases

3 Fundamento Términos utilizados en las medidas de Absorción Molecular. Potencia radiante, P/Po: Energía (en ergios) de la radiación que incide en el detector por cm 2 y por segundo.

4 Fundamento Ley de Beer. La potencia del haz, P x, que entra en la sección es proporcional al número de fotones por cm 2. El diferencial dP x, representa la cantidad adsorbida en la sección. La relación dS=a*d n, representa la sección transversal de captura, donde d n es el número de partículas y a es una constante de proporcionalidad. (1) (2) Combinando 1 y 2 e integrando entre 0 y n, tenemos : Integrando obtenemos: Re-arreglando: (3) (4) (5)

5 Fundamento Ley de Beer. El área de la sección transversal, puede expresarse en términos de volumen, V cm 3 y su longitud b en cm. Sustituyendo S, en la ecuación (5): Para n partículas, tenemos que n es : (11) Podemos convertir n/V en mol/L: Combinando la ecuación (6) con la (9), nos queda: (6) (7) (8) (9) Agrupando las contantes en un único término ɛ, nos queda: (10)

6 Fundamento Aplicación de la Ley de Beer a mezclas, Si no hay interacción entre las especies absorbentes, la ley de Beer para un sistema multicomponente puede expresarse como La intensidad de un haz de luz monocromatica, que incide de forma perpendicular sobre una muestra, decrece exponencialmente con la concentración de la muestra. (4) Enunciado de la Ley de Beer Luego, la Absorbancia, A, es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente y a la longitud del camino óptico. (12) (13) (14)

7 Fundamento  La ley de Beer es una ley límite aplicable a concentraciones de analito por debajo de 0,01M, por encima de esta concentración ocurren desviaciones de linealidad entre la absorbancia y la concentración. (4) Desviaciones de la Ley de Beer /Propias  También se producen desviaciones de la Ley de Beer, debido a la dependencia de ɛ con el índice de refracción del medio,n. Se hace la correción mediante la ecuación:  Para ciertos iones o moléculas orgánicas grandes, a muy bajas concentraciones del orden de 10 -5 a 10 -6 M, se ha observado que no se cumple la Ley de Beer.

8 Fundamento  Cuando un analito, se disocia, se asocia o reacciona para formar un producto con un espectro de absorción diferente al del analito, se producen desviaciones de la Ley de Beer. Desviaciones de la Ley de Beer /Químicas Ejemplo: Color 1 Color 2 Concentración de HIn e In -, para disoluciones no tamponadas del indicador cuya concentración varía entre 2x10-5M y 16x10-5 M. Desviaciones químicas de la ley de Beer

9 Fundamento  La Ley de Beer, se cumple estrictamente sólo para radiación monocromática, por tanto la radiación policromática produce ciertos cambios en esta ley. Desviaciones de la Ley de Beer /Instrumentales Consideremos un haz de luz formado por dos longitudes de onda, ’ y ’ ’, asumiendo que la Ley de Beer, se cumple de forma estricta para ambas Longitudes de onda, podemos expresar que: Despejando P’ de la última ecuación, nos queda que: De igual forma, para ’’, nos queda que: (15) (16) (17) (18)

10 Fundamento  La Ley de Beer, se cumple estrictamente sólo para radiación monocromática, por tanto la radiación policromática produce ciertos cambios en esta ley. Desviaciones de la Ley de Beer /Instrumentales Para el haz de luz formado por dos longitudes de onda, ’ y ’ ’, la Absorbancia se puede expresar como: Sustituyendo P’ y P” se convierte en : Cuando ɛ’=ɛ’’, esta ecuación se simplifica : (19) (20) (21)

11 Fundamento La relación entre Am y la concentración deja de ser lineal, cuando las absortividades molares, Ɛ, difieren entre sí. Desviaciones de la Ley de Beer /Instrumentales La luz policromática no afecta la Ley de beer siempre y cuando, se trabaje en una zona del espectro donde la absorbancia en función de la longitud de onda, sea casi constante.

12 Fundamento Radiación Parásita : esta proviene de dispersiones y/o reflexiones en varias superficies internas de la celda de muestra. Esta radiación difiere en longitude de onda respecto a la de la radiación principal y probablemente no atraviesa la muestra. Desviaciones de la Ley de Beer /Instrumentales La absorbancia en presencia de radiación parásita, viene expresada por: Donde P s es la potencia de radiación parásita, no absorbida. Desviación de la Ley de Beer debido a radiación parásita P s de distinta intensidad (22)

13 Fundamento Ruido Instrumental como función de la Transmitancia Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos La relación entre el ruido encontrado en la medida de T y la incertidumbre en la medida de concentración, se deduce según La siguiente ecuación: Tomando la derivada parcial, respecto a T y manteniendo b y c constantes, nos queda que:. (23) (24)

14 Fundamento Ruido Instrumental como función de la Transmitancia Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos Aplicando… Dividiendo esta ecuación por la de la concentración, nos queda que: (25) (26)

15 Fundamento Ruido Instrumental como función de la Transmitancia Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos Dividiendo la ecuación (26) por el cuadrado de la ecuación (25), nos queda que: (27) (28)

16 Fundamento Ruido Instrumental como función de la Transmitancia Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos Para un número limitado de medidas, se remplaza la desviación estándar de la población,  c y  T por la desviación estándar de la muestra s C y s T, nos queda que: (29) Esta ecuación relaciona la desviación estándar relativa Sc/C con la desviación estándar absoluta de la medida de la transmitancia, S T. Se observa que la incertidumbre en la medida fotométrica de la concentración varía de forma no lineal con la magnitud de la transmitancia.

17 Fundamento Tipos y Fuentes de incertidumbre en las medidas de la Transmitancia Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos CategoríaEcuaciónFuentes CaracterísticasImportancia Caso I Resolución de Lectura limitada. Ruido de Johnson de detector térmico. Corriente oscura y ruido del amplificador En fotómetros baratos y espectrofotómetros con escala de medidas de transmitancia pequeñas. Espectrofotómetros y Fotómetros IR e IR cercanos. Regiones en las que la intensidad de la fuente y la sensibilidad del detector son bajas. Caso II Ruido de disparo del detector de fotones Espectrofotómetros UV/Visible de alta calidad. Caso III Incertidumbres en la posición de la cubeta. Parpadeo de la Fuente Espectrofotómetros UV/Visible e IR de alta calidad. Fotómetros y espectrofotómetros baratos

18 Fundamento Precisión Relativa de las medidas de la Concentración en función de la transmitancia y absorbancia, para las tres categorias de ruido instrumental. Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos

19 Fundamento Incertidumbres relativas en la Concentración provocadas por distintas categorias de ruidos instrumentales. A:caso I, B:caso II y C: caso III. Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos

20 Fundamento Cuando la precisión esta limitada por el ruido de disparo se puede abarcar un mayor intervalo de absorbancias sin que hayan perdidas notables de exactitud. Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos Un mayor intervalo de absorbancias, representa una ventaja de los detectores fotónicos sobre los detectores térmicos. Ruido Tipo II Este tipo de ruido, limita a menudo la precisión de los equipos de mayor calidad. Tiene su origen en el ruido de disparo, el cual se presenta siempre que el paso de electricidad incluya la tranferencia de carga a través de una union.

21 Fundamento Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos El efecto del ruido de disparo sobre Sc, se obtiene según la sguiente ecuación: Ruido Tipo II Los instrumentos limitados por el ruido de disparo, no generan datos de concentración fiables cuando las transmitancias son mayors al 95% o la absorbancia es menor 0,02,

22 Fundamento Experimentalmente las celdas de muestra y de referencia se matienen en una posición fija, durrante el calibrado y análisis de muestra. Efecto del Ruido Instrumental en los Análisis Espectrofotométricos El efecto de las incertidumbres proporcionales a la transmitancia, se representa en la siguiente ecuación:. Ruido Tipo III Una de las causas de este tipo de ruido, se debe a la lenta deriva en la señal de salida radiante de la fuente, se le denomina ruido de parpadeo. Otra fuente de ruido se debe a la falta de reproducibilidad en la posición de las celdas de muestra y de referencia, respecto al haz de luz.

23 Fundamento Efecto de la Anchura de Rendija en las medidas de absorbancia La resolución del Espectro es mejor cuando se utilizan anchuras de rendijas estrechas. Una disminución en la anchura de la rendija, produce una reducción exponencial de Segundo orden en la energía radiante. Debe haber un valor compromiso en el ancho de rendija, de forma de obtener una buena resolución y no perder detalles espectrales. Efecto de la anchura de banda en la definición espectral.

24 Fundamento Efecto de la Anchura de Rendija en las medidas de absorbancia Efecto de la anchura de rendija y de la anchura de banda en la altura de picos. La muestra es una disolucio´n de cloruro de praseodominio.

25 Fundamento Efecto de la radiación Dispersa de longitudes de onda extremas de un instrumento Espectro de Ce(IV) obtenido con un espectrofotómetro con óptica de virio (A) y óptica de cuarzo (B). El falso pico en (A) surge de la transmisión de radiación parásita de longitudes de ondas más largas. La medición de absorbancia a longitudes de onda extremas, puede ocasionar la aparición de falsos picos de absorción. En algunos casos, la señal de salida de la radiación parásita puede exceder a la del haz que proviene del monocromador Por tanto, la absorbancia medida proviene tanto de la radiación parásita como del haz de medida.

26 Fundamento Instrumentación 1) Fuente de Luz. 2) Selector de Longitud de Onda 3) Recipiente para la Muestra. 4) Detector de Radiación. 5) Procesamiento de Datos. Lampara de Deuterio e Hidrógeno.

27 Fundamento Instrumentación La excitación eléctrica del Deuterio e Hidrógeno produce un espectro continuo en la región Ultravioleta. Lámpara de Deuterio e Hidrógeno. Molécula de Deuterio Excitada Fotón Ultravioleta La energía global del proceso, se expresa por la ecuación:

28 Fundamento Instrumentación Lámpara de Deuterio e Hidrógeno. Estas lamparas contienen hidrogeno o deuterio gaseosos y emiten en la region UV. Se aplica una diferencia de potencial de 40 V y se produce un arco entre un filamento caliente recubierto con óxido y un electrodo metálico. Espectro continuo entre 160 y 375 nm, Posee alta estabilidad, larga vida útil y alto brillo.

29 Fundamento Instrumentación Lámpara de Wolframio. Su distribución de energía se aproxima a la de un cuerpo negro, por tanto depende de la temperatura. El filamento de wolframio trabaja a una temperatura de 3000 K. La region spectral útil está entre 350 y 2500 nm. El tiempo de vida de estas lámparas es elevado.

30 Fundamento Instrumentación Lámpara de Arco de Xenón. Estas lámparas emiten radiación intensa, debido a la descarga eléctrica que se produce entre los dos electrodos, sometidos a una diferencia de potencial en el seno de la atmosfera de xenón. El espectro es continuo en un intervalo entre 185 y 2000nm. La lámpara posee dos electrodos, uno actua como cátodo y otro como ánodo, contenidos dentro de un bulbo de vidrio que contiene el gas. Ambos tipos de lámpara poseen alto rendimiento, alta estabilidad y larga vida útil. Lámpara de Arco de Xenón-Mercurio. La lámpara contiene una mezcla de gas xenon y mercurio. La lámpara xenon-Hg presenta el mismo espectro que la de xenon, prsenatando picos Fuertes en la region UV y visible, debido a las lineas espectrales del mercurio.

31 Fundamento Instrumentación Recipientes para la Muestra.  El camino óptico de las celdas de muestra, es comúnmente de 1cm, no obstante las hay desde 0,1 cm hasta 10 cm.  Los recipientes deben tener caras perfectamente perpendiculares a la dirección del haz de radiación.  Las cubetas deben limpiarse por completo antes y después de utilizarlas. La superficie de las ventanas no deben tocarse durante la manipulación de las cubetas.  La posición de la cubeta respecto al haz, debe ser reproducible. Esto para evitar variaciones en el camino óptico y perdidas por reflexión.

32 Fundamento Instrumentación Recipientes para la Muestra.  Por debajo de 350nm, se requieren recipientes de cuarzo o sílice fundida. Son transparentes en el visible e Ir.  Los vidrios silicatados, pueden utilizarse en la región entre 350 y 200 nm.  Los recipientes de plástico, también son utilizados en el visible.

33 Fundamento Instrumentación Recipientes para la Muestra.

34 Fundamento Instrumentación/ Tipos de Instrumentos  Haz sencillo.  Doble Haz Espacial.  Doble Haz Temporal.  Multicanal. Fuente Selector de Longitud de Onda Muestra Detector Esquema de Un Instrumento típico de absorción Molecular

35 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Haz sencillo.  Un instrumento de haz sencillo puede constar de un bombillo de wolfamio,como fuente de radiación, filtros de vidrio para aislar la longitude de onda, tubos de ensayo para contener la muestra y una célula fotovoltaica como detector.  Un instrument de un solo haz sostificado, puede constar de lámparas de wolframio-mercurio intercambiables, cuebtas de sílice, monocromador de red de alta resolución y tubos fotomultiplicadores para la detecci{on.

36 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Doble Haz.  Un instrumento de doble haz en el espacio.Utiliza un divisor de haz que forma dos haces en el espacio.  Un haz pasa a través de la disolución de referencia y continua hasta el fotodetector. Simultanemanete un segundo haz atraviesa la muestra hasta un detector constrastado. Las dos señales de salida se amplifican y su cociente se determina electronicamente.

37 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Doble Haz.  Los haces se separan en el tiempo, mediante un espejo rotatorio que dirge el haz que emerge del monocromador, primero a través de la cubeta de referencia y luego a traves la muestra de la cuebta de la muestra.  Los impulsos de radiación se recombinan mediante otro espejo en sectores que transmite un impulso y refeljan el otro hacia el detector. Instrumento del tipo nulo, el haz que pasa a través del disolvente se atenúa, hasta que su intensidad iguala, a la del haz que pasa por la muestra.

38 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Multicanales.  Utilizan un detector de fotodiodos en serie.  La radiación que incide sobre la superficie de un diodo, da lugar a una descarga parcial de su condensador.  La corriente de carga es proporcional a la potencia de radiación, se amplifica,digitaliza y se almacena en la memoria del computador.  La senal de salida de cada diodo, corresponde a la radiación de cada longitud de onda y el espectro se obtiene mediante barrido secuencial.

39 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Comparación.  Compensan las fluctuaciones en la radiación tanto de la fuente como de las derivas del detector y del amplifiacador.  Compensan las grandes variaciones en la intensidad de la luz de la fuente con la longitud de onda.  Permite el registro continuo de los espectros de absorbancia y transmitancia. Doble Haz Multicanal  Es un instrumento adecuado para monitorear estudios cinéticos, Determinaciones cualitativas y cuantitativas en cromatografía de líquidos o en electroforésis capilar.  Se pueden realizar análisis simultaneos.  La resolución es limitada, de 1 a 2nm y los costos son relativamente altos.

40 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Fotómetros.  El fotómetro está formado por una lámpara de filamento de wolframio, una lente que enfoca un haz de luz paralelo, un filtro y una célula fotovoltaica.  La corriente producida se indica con un microamperímetro en cuya superficie lleva una escala lineal de 0 a 100.  La lectura de la escala en el micro-amperimetro indica directamente el porcentaje de transmitancia, cuando se coloca la muestra en la trayectoria del haz de luz. Fotómetro de un solo haz

41 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Fotómetros.  El haz de luz se divide mediante un espejo semiplateado, que transmite el 50% del haz incidente y refleja el otro 50%.  Un haz pasa a través de la muestra y de allí a la célula fotovoltaica y el otro haz pasa a la referencia y a otro detector.  Se utiliza un detector de punto nulo. Fotómetro de doble haz

42 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Fotómetros.  Utiliza una fibra óptica para transmitir la luz, desde la fuente del haz incidente hasta la disolución, que se encuentra entre en el vidrio sellado en el extremo final de la fibra y el espejo.  Una segunda fibra óptica recoge le haz reflejado en el espejo, hasta alcanzar el fotodiodo.  Se utilizan seis filtros de interferencia intercambiables, que trabajan en la región entre 420 y 900 nm. Fotómetro Tipo Sonda  El filtro más adecuado para el análisis fotométrico, será el que posee el color complementario al color de la disolución a analizar.  La absorbancia se mide sumergiendo la sonda primero en el disolvente y luego en la disolución a analizar.

43 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Espectrofotómetros/ Región Visible  Trabajan en el intervalo de longitudes de onda entre 380 a 800 nm.  En general, son de un solo haz.  Sencillos, baratos, portátiles y robustos.  Adecuados para el análisis cuantitativo.

44 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Espectrofotómetros Región Visible.  El ajuste del 0 al 100% de Transmitancia se realiza con un obturador.  El intervalo de longitud de onda está comprendido entre 340 y 625 nm, un fototubo adicional aumenta el intervalo hasta 950nm.  Posee una anchura de banda de 20 nm y una exactitud en la longitud de onda de ± 2,5 nm. Espectrofotómetro Spectronic 20

45 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos  La fuente de radiación son lámparas de wolframio y de hidrógeno o de Deuterio intercambiables.  El intervalo de longitud de onda inferior está comprendido entre 190 a 210 nm y el superior de 800 a 1000 nm.  Utilizan monocromador de red como selector de longitud de onda, también pueden utilizarse redes concavas y redes holográficas  Las anchura de banda sulen variar de 2 a 8 nm y exactitudes en la longitud de onda de ± 0,5 nm a ± 2,0 nm  Se utiliza fotomultiplicador como detector y el equipo no posee registrador. Espectrofotómetros Haz Sencillo-Región UV- Visible.

46 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos  El intervalo de trabajo en la región espectral es de 190 a 800 nm.  Son espectrofotómetros de haz sencillo, con registrador y controlados por computador.  Inicialmente se reliza un barrido con la disolución de referencia y luego con la muestra, la absorbancia se calcula con los datos digitalizados y almacenados en la memoria del computador.  El espectro completo se visualiza en un tubo de rayos catódicos en 2 seg después de la adquisición de los datos.  Las velocidades de barrido son de hasta 1200 nm/min. Espectrofotómetros Haz Sencillo Computarizado.  Las exactitudes fotómetricas son de ± 0,005 A o ± 0,3 por 100 de Transmitancia con una deriva menor de 0,002 A/h.  Se dispone de anchuras de banda de 0,5, 1 y 2 nm.

47 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos  Son más costosos, que los instrumentos de un sólo haz. Espectrofotómetros de Doble Haz Espectrofotómetro de Doble haz manual para la región UV/Visible.  La radiacion se dispersa en una red concava, que enfoca el haz sobre un espejo en sectores rotatorios.  Intervalo de longitud de onda de 195 a 850nm.  Anchura de banda de 4 nm.  Exactitud fotometrica del 0,5 por 100 de T y reproducibilidad del 0,2 por 100 de A.  Radiacion parasita menor del 0,1 por 100 de Po a 240 y 340 nm.

48 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Espectrofotómetros de Doble Haz Con registrador para la región UV/Visible. Perkin Elmer Serie 57  Instrumento de Doble canal en el tiempo.  Red Plana de 45mmx45mm con 1440 líneas/mm.  Intervalo Espectral de 190 a 750 nm.  Anchuras de banda de 0,2; 0,5; 1 y 2 nm.  Exactitud fotométrica de ±0,003 A.  Radiacion parásita menor del 0,1 por 100 de Po a 220 y 340 nm.

49 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Espectrofotómetro de Doble dispersión (Cortesía de varian Instrument Division, Palo Alto).  El Instrumento consta de dos monocromadores configurados en serie.  Se mejora la resolución espectral y se disminuye la radiación parásita.  El haz de radiación sufre una doble dispersión y se divide en dos haces, uno atraviesa la muestra y el otro la referencia.  Resolución de 0,07 nm.  Radiacion parásita menor del 0,0008 por 100 de Po de 220 a 800 nm.  Intervalo Espectral de 185 a 3125 nm. Espectrofotómetros de Doble Dispersión

50 Fundamento Instrumentación/Tipos de Instrumentos Espectrofotómetro Multicanal de Diodos en serie,HP 8452 A, (Cortesía de Hewlett-Packard Company, Palo Alto C.A.)  Se obtiene el espectro mediante un barrido electrónico.  Se pueden realizar determinaciones simultáneas de multi- componentes.  La lámpara de deuterio sirve como fuente única de radiación desde el UV hata 820 nm..  Se utiliza una red de reflexión holográfica y el detector es un arreglo de diodos de 328 ellementos.  Resolución Espectral de 2 nm. Espectrofotómetros de Diodos en serie  Alta reproducibilidad y elevada relación senal ruido.  Se minimiza la fotodescomposición de la muestra.