C. del Barrio, L. Embún, B. García, G. Miró, R. Pinacho, D. S. Rivera

Presentación del tema: "C. del Barrio, L. Embún, B. García, G. Miró, R. Pinacho, D. S. Rivera"— Transcripción de la presentación:

1 C. del Barrio, L. Embún, B. García, G. Miró, R. Pinacho, D. S. Rivera
DNA POLYMERASES: A Structural Approach C. del Barrio, L. Embún, B. García, G. Miró, R. Pinacho, D. S. Rivera

2 Table of contents INTRODUCTION STRUCTURAL DESCRIPTION
DNA SYNTHESIS PATHWAY DNA-ENZYME INTERACTIONS ACTIVE SITE EVOLUTIVE FEATURES CONCLUSIONS

3 DNA Replication Important in all known life forms
Process of copying a double-stranded DNA molecule Important in all known life forms Each DNA strand holds the same information, so both strands can serve as templates for the reproduction of the opposite strand Template strand is preserved and new strand is assembled from nucleotides: semiconservative replication Resulting double-stranded DNA molecules are identical Proofreading and error-checking mechanisms ensure fidelity Prokaryotes Eukaryotes between cell divisions during S phase preceding mitosis or meiosis I DNA replication is also performed in the laboratory: PCR

4 removes the ribonucleotide primer (5’-3’ nuclease activity)
DNA Replication Synthesis of DNA proceeds from a replication fork where the strands of the parent DNA are separated Both strands serve as templates for replication during which new DNA strands are 5’-3’ synthesized One strand is synthesized as a continuous chain The other strand (which uses 5’-3’ parent strand as template) is made as a series of short DNA molecules: Okazaki fragments Okazaki fragments require an RNA primer at 5’ ends to initiate DNA synthesis started by DNA pol III adds nucleotides in 5’-3’ until it encounters RNA primer of previous Okazaki fragment 5’ Parental DNA duplex Direction of fork movement Daughter duplex Leading strand Short RNA primer Okazaki fragment Lagging strand Point of joining 3’ removes the ribonucleotide primer (5’-3’ nuclease activity) continues DNA synthesis by filling the gaps with deoxyribonucleotides (polymerase activity) DNA pol I

5 DNA Replication  OTHER IMPORTANT ENZYMES INVOLVED IN DNA REPLICATION
Helicase Separates the double-helical configuration Topoisomerase Catalyzes and guides unknotting of DNA (topological unlinking of the 2 strands) SSB / SSBP Bind to single-strands, keeping them separated and allowing DNA replication machinery to perform its function RNA primase Performs new RNA primer synthesis No known DNA pol can initiate the synthesis of a DNA strand without initial RNA primers DNA ligase Its nick sealing joins new Okazaki fragment to the growing chain

6 DNA polymerase families
Family Main members Features Are they crystallized? A Prokaryotic DNA pol I mitochondrial pol γ phage pols T3, T5 and T7 Found primarily in organisms related to prokaryotes Yes [92 entries] B Phage pols T4 and T6 herpes virus pol archeal pol “Vent” mammalian pols α, δ and ε Present in phages, viruses, archea and eukaryotes Many of these pol function replicate the host genome [17 entries] X Mammalian pols β, λ and μ Function during DNA repair [117 entries] RT RTs from retroviruses eukaryotic telomerases Use of a RNA template to synthesize the DNA strand [158 entries] most MMLV and HIV Pol III Bacterial DNA pols Replicate the majority of bacterial genomes [135 entries] UmuC/DinB Pols η, ι and κ Rev1 (terminal deoxycytidyl transferase) TLS pols, which have low fidelity on undamaged templates and replicate through damaged DNA MMLV: Moloney Murine Leukaemia Virus TLS: translesion synthesis

7 DNA polymerase I lineage
Class Multi-domain proteins (alpha & beta) Folds consisting of 2 or more domains belonging to different classes Fold DNA/RNA polymerases 3 morphological domains (“palm”, “thumb” and “fingers”) All members conserve the “palm” domain Superfamily “Palm” domain has a ferrodoxin-like fold, related to that of an adenylyl cyclase domain 6 members Family DNA polymerase I Protein domain DNA polymerase I (Klenow fragment) Species Escherichia coli Termophilus aquaticus

8 DNA polymerase I domains
3’-5’ exonuclease 5’-3’ exonuclease Klenow fragment primer DNA template N C 3’ 5’ residue number 928 518 324 1 distance between polymerase active site and exonuclease binding site = 30 Å

9 this strand determines which deoxyribonucleotide will be added
DNA polymerase I functions  POLYMERASE REACTION T 3’ 5’ primer strand -OH A template strand T -OH 5’ 3’ C A It catalyzes stepwise addition of a deoxyribonucleotide to 3’-OH end of the primer strand that is paired to a second template strand The new strand grows in 5’-3’ direction Each incoming deoxyribonucleoside triphosphate must pair with the template strand to be recognized by pol this strand determines which deoxyribonucleotide will be added

10 DNA polymerase I functions
 3’-5’ EXONUCLEASE ACTIVITY One domain catalyzes hydrolysis of nucleotides at the 3’ end of DNA chains To be removed, a nucleotide must have a free 3’-OH terminus and must not be part of a double helix A 5’ 3’ hydrolysis site T G  5’-3’ EXONUCLEASE ACTIVITY 5’ 3’ A hydrolysis site G T The second domain hydrolyzes DNA starting from the 5’ end of DNA It can occur at the 5’ terminus or at a bond several residues away from it The cleaved bond must be in a double-helical region

11 Taq DNA polymerase I: structure and domains

12 instead of the one from E. coli?
Why do we use Taq polymerase I instead of the one from E. coli? Para hacer toda la parte estructural y hablar sobre cómo se producen las interacciones de la DNA polimersa I con su sustrato, nos hemos basado en pdbs de Termophilus aquaticus, comparándolos también con información de artículos sobre E.coli. Este uso alterno se justifica por la alta homología existente entre ambas moléculas, para comprobarlo realizamos alineamientos estructurales y de secuencia, que os mostrará Estefi más adelante. En la imagen se muestra el resutado del alineamiento estructural de los fragmentos Klenow y klentaq. RMSD: 1,75 RMS: 1.75 Taq polymerase I (Klentaq fragment) [3KTQ] E. coli polymerase I (Klenow fragment) [1D8YA]

13 Taq polymerase I N-term C-term PDB: 1CMW
En esta imagen, mostramos la DNA polimerasa I deThermophilus aquaticus. El gradiente de color “caliente-frío” nos muestra la “dirección de la molécula”, desde el extremo N-terminal (azul) hasta el C-terminal en rojo. Estos colores van a servirnos para orientarnos sobre la molécula al hablar se sus dominios. DNA polymerase I consists of the polymerase, the structure-specific nuclease and the vestigial editing nuclease domains. Three-dimensional structures of the native enzyme and its complex with DNA have already been reported. The structure of a complex with an inhibitory antibody has also been determined. The structure of the native enzyme in a different crystal form determined at 2.6  Å is reported here. Optimized anomalous diffraction measurements made at the holmium LIII edge were valuable in validating solutions obtained through molecular replacement. The structure of the polymerase domain is similar to those reported previously, while the relative orientation of the structure-specific nuclease domain is significantly different from those of the native enzyme and the DNA complex; it is, however, identical to that observed in the structure of the Fab complex. In the structures of the native enzyme and of the DNA complex reported previously, the active site of the structure-specific nuclease domain is too far from that of the polymerase domain, making it difficult to propose a structural model for the in vivo primer-excision and nick-translation activities of the enzyme. In the present structure, the two active sites are considerably closer. Taken together, the reported structure of the native enzyme, that of the Fab complex and the present structure imply that the different orientation of the structure-specific nuclease domain is probably a consequence of intrinsically high relative mobility between these two domains in this enzyme. N-term C-term PDB: 1CMW

14 Taq polymerase 5’-3’ exonuclease domain Klentaq fragment PDB: 1CMW
Thermus aquaticus DNA polymerase I consists of the polymerase, the structure-specific nuclease and the vestigial editing nuclease domains. Three-dimensional structures of the native enzyme and its complex with DNA have already been reported. The structure of a complex with an inhibitory antibody has also been determined. The structure of the native enzyme in a different crystal form determined at 2.6  Å is reported here. Optimized anomalous diffraction measurements made at the holmium LIII edge were valuable in validating solutions obtained through molecular replacement. The structure of the polymerase domain is similar to those reported previously, while the relative orientation of the structure-specific nuclease domain is significantly different from those of the native enzyme and the DNA complex; it is, however, identical to that observed in the structure of the Fab complex. In the structures of the native enzyme and of the DNA complex reported previously, the active site of the structure-specific nuclease domain is too far from that of the polymerase domain, making it difficult to propose a structural model for the in vivo primer-excision and nick-translation activities of the enzyme. In the present structure, the two active sites are considerably closer. Taken together, the reported structure of the native enzyme, that of the Fab complex and the present structure imply that the different orientation of the structure-specific nuclease domain is probably a consequence of intrinsically high relative mobility between these two domains in this enzyme. Linker region (links Klentaq to N-term fragment) PDB: 1CMW

15 5’-3’ exonuclease domain
Fold: SAM domain-like [47768] 4-5 helices; bundle of two orthogonally packed alpha-hairpins; involved in the interactions with DNA and proteins REsolvase-like: Core: 3 layers alpha/beta/alpha; mixed beta sheet of 5 strands, ordered 21345; strand five is antiparallel to the rest (en las resolvasas) Aquí es lo mismo, pero sin la 5ª hoja lámina beta antipalalela. Fold: PIN domain-like [88722] 3 layers, a/b/a; core: parallel beta-sheet of 5 strands, order 32145 Superfamily: PIN domain-like [88723] Family: 5' to 3' exonuclease catalytic domain [53045] contains an alpha-helical arch and additional strand 6 antiparallel to the rest; strand order ; similarity to the resolvase-like fold The N-terminal and internal 5'3'-exonuclease domains are commonly found together, and are most often associated with 5' to 3' nuclease activities. The XPG protein signatures () are never found outside the '53EXO' domains. The latter are found in more diverse proteins PUBMED: , PUBMED: , PUBMED: The number of amino acids that separate the two 53EXO domains, and the presence of accompanying motifs allow the diagnosis of several protein families. In the eubacterial type A DNA-polymerases, the N-terminal and internal domains are separated by a few amino acids, usually four. The pattern DNA_POLYMERASE_A () is always present towards the C-terminus. Several eukaryotic structure-dependent endonucleases and exonucleases have the 53EXO domains separated by 24 to 27 amino acids, and the XPG protein signatures are always present. In several proteins from herpesviridae, the two 53EXO domains are separated by 50 to 120 amino acids. These proteins are implicated in the inhibition of the expression of the host genes. Eukaryotic DNA repair proteins with 600 to 700 amino acids between the 53_EXO domains all carry the XPG protein signatures. N-term resolvase-like domain C-term SAM fold PDB: 1CMW

16 3’-5’ exonuclease-like domain Linker region (links to N-term fragment)
Klentaq fragment Thumb Palm 3’-5’ exonuclease-like domain Fingers Linker region (links to N-term fragment) The X-ray crystal structures of these polymerases resemble in overall morphology a cupped human right hand, with fingers (which bind an incoming nucleotide and interact with the single-stranded template), palm (which harbors the catalytic amino acid residues and also binds an incoming dNTP) and thumb (which binds double-stranded DNA) subdomains. Estos tres sub-dominios: pulgar, dedos y palma, forman el dominio con actividad polimerasa. En posición 5’ respecto a este dominio, encontramos un dominio homólogo al dominio 3’-5’ exonucleasa de E.coli, aunque en Taq carece de actividad catalítica. Finalmente, en la porción más 5’ del fragmento Klenow, encontramos una región que se encarga de unir el fragmento klenow al domino N-terminal de actividad exonucleasa 5’-3’ (el cual NO aparece en la imagen). PDB: 3KTQ

17 3’-5’ exonuclease-like domain
Klentaq fragment Thumb Palm 3’-5’ exonuclease-like domain Fingers The X-ray crystal structures of these polymerases resemble in overall morphology a cupped human right hand, with fingers (which bind an incoming nucleotide and interact with the single-stranded template), palm (which harbors the catalytic amino acid residues and also binds an incoming dNTP) and thumb (which binds double-stranded DNA) subdomains. Estos tres sub-dominios: pulgar, dedos y palma, forman el dominio con actividad polimerasa. En posición 5’ respecto a este dominio, encontramos un dominio homólogo al dominio 3’-5’ exonucleasa de E.coli, aunque en Taq carece de actividad catalítica. Finalmente, en la porción más 5’ del fragmento Klenow, encontramos una región que se encarga de unir el fragmento klenow al domino N-terminal de actividad exonucleasa 5’-3’ (el cual NO aparece en la imagen). PDB: 3KTQ

18 DNA polymerase I Klenow fragment
LARGE DOMAIN C N 14 9 13 12 8 7 α+β Type with 6-stranded antiparallel β sheet Connection between β strands 9 and 12 makes a long excursion that builds up one side of the DNA-binding cleft It contains helices L-Q as well as the antiparallel hairpin of β strands 11 and 12

19 DNA polymerase I Klentaq fragment
LARGE DOMAIN En la reguón palma :2 layer sandwich  hacer k se vea mejor el sanwich Fold: DNA/RNA polymerases [56671] divided into morphological domains including "palm", "thumb" and "fingers"; the catalytic "palm" domain is conserved to all members "palm" domain has a ferredoxin-like fold, related to that of an adenylyl cyclase domain Up-down bundle: up-and-down is the simplest topology for a helical bundle or folded leaf, in which consecutive helices are adjacent and antiparallel; it is approximately equivalent to the meander topology of a beta-sheet. (meander: meander is a simple topology of a beta-sheet where any two consecutive strands are adjacent and antiparallel) PDB: 3KTQ

20 nucleotide binding site
DNA pol Klenow fragment SMALL DOMAIN C nucleotide binding site 5 2 3 4 1 α/β Type with 1 antiparallel βstrand 5-stranded βsheet with 2 connecting helices and 1 helix (C) at the carboxy terminus (E.coli) Alfa/beta: two layer sandwich Fold: Ribonuclease H-like motif [53066] 3 layers: a/b/a; mixed beta-sheet of 5 strands, order 32145; strand 2 is antiparallel to the rest Pero aquí tenemos 4!!! UNIQUE TOPOLOGY FOR A MIXED β SHEET

21 Highly conserved regions
To see whether there was a consensus pattern among different species we performed this alignment with a HMM and representative members of eucariotic and procariotic world. We see three mainly conserved motifs, the so called A, B and C motifs.

22 Region 1 Region 2 Motif A Motif B Region 6 Motif C
Highly conserved regions Region 1 Region 2 Motif A Motif B Region 6 Motif C Analysis of high-resolution crystal structures of family A polymerases in complex with DNA and an incoming nucleotide suggests each of these six regions have an important role during DNA synthesis. Region 1 amino acid residues are located at the tip of the thumb subdomain and form a helix-loop that interacts with the minor groove of the double-stranded DNA during the nucleic acid binding step. Region 2 amino acid residues are located within the palm subdomain and interact with the template strand (along the minor groove) and thus, form the ``template grip''. Region 6 amino acid residues interact with the first template base; as a result, this template could be fliipped out'' of the helix axis by >=90 º, such that it cannot base-pair with the incoming dNTP . Amino acid residues within regions 3, 4, and 5 correspond to motifs A, B, and C, respectively, and are located near the incoming nucleotide triphosphate and thus form portions of the dNTP binding cleft within the DNA polymerase active site. Motifs A and C are located within the palm subdomain while motif B is located in the fingers subdomain.

23 Motif A “DYSQIELR” Asp610 Hydrophobic residues
Motif A begins at an antiparallel b-strand containing predominantly hydrophobic residues and continues to an alpha helix. Amino acid sequences of a large variety of naturally occurring prokaryotic DNA Pol Is show many sequences can produce the``antiparallel b-strand'' portion of motif A; however, the ``turn and a-helix'‘ portions consistently contain the ``DYSQIELR'' amino acid sequence. En la imagen podemos ver el motivo A en color verde y a su vez se encuentra representada la Asp610 la cual se encuentra conservada en diferentes especies. En lila podemos ver respresentados los aminoácidos hidrofóbicos

24 Motif B “RRxhKhhNFGhhY” Arg659 Lys663 Gly668 Tyr671
Motif B constitutes an a-helix located in the fingers subdomain and is found in both A and B families of DNA polymerases. DNA Pol I sequence alignment indicates motif B contains a consensus sequence RRxhKhhNFGhhY, where h represents hydrophobic amino acid and x indicates any amino acid. En la imagen podemos ver representado en lila el motivo B. En rojo se encuentran representados aminoácidos conservados en diferentes especies. Concretamente los residuos representados son los siguientes: Arg659, Lys663, Gly668 y Tyr671.

25 Motif C His784 Asp785 “HDE” Structurally, motif C amino acids form two antiparallel b-strands. While diverse amino acid sequences form the antiparallel b-strands, the loop between these strands invariably contains the sequence ``HDE''. En la imagen podemos ver representado en rosa el motivo C. En rojo podemos ver los aminoácidos conservados en diferentes especies: His784 y Asp785.

26 PATHWAY OF DNA SYNTESIS
Part 1: DNA binding Una vez definidos la estructura y los dominios de la Taq polimerasa vamos a pasar a hablar de la vía de síntesis de ADN. El primer paso de esta vía es la unión de la polimerasa al ADN.

27 Pathway of DNA Synthesis
E+TP E-TP dNTP 1 2 3 4 E-TP-dNTP PPi E-TPn+1-PPi E-TPn+1 1 Polymerase (E) binds with template-primer (TP) 2 Appropriate dNTP binds with polymerase-DNA complex 3 Nucleophilic attack results in phosphodiester bond formation 4 Pyrophosphate (PPi) is released rate limiting step phosphodiester bond formation Pero antes de pasar a este primer paso de la síntesis de ADN vamos a realizar una pequeña introducción al proceso, ya que al ser algo complejo es mejor establecer antes sus pasos principales. Así, en un primer paso, la DNApol (identificada como E en la ecuación superior) se une al primer molde (template primer) representado en la ecuación por TP. A continuación, el complejo DNApol-DNA reconoce y une un deoxynucleosido 5'-trifosfato (dNTP) el cual se empareja cpn el template correspondiente para formar un base pair. Una vez se produce la interacción de la proteína con el sustrato, se produce el ataque nucleofílico del mismo, que acaba con la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 3 hidroxilo del primer y el nuevo Dntp, con la consiguiente liberación de un pirofosfato. La unión del ADN y la unión de nucleótidos ocurre muy rapidamente, sin embargo, en esta reacción, como en casi todas las reacciones enzimáticas, hay dos pasos limitantes, que van a determinar si puede llevarse a cabo: Formación del enlace fosfodiéster Cambio conformacional que precede a la incorporación de nucleótido (paso de conformación abierta a cerrada?). En este paso intervienen diferentes interacciones dinámicas entre la polimerasa y sus sustratos que voy a tratar de describiros con más detalle en las siguientes diapositivas. conformational change preceding nucleotide incorporation dynamic interactions between polymerase with its nucleic acid and dNTP substrates

28 Pathway of DNA Synthesis
E+TP E-TP dNTP 1 2 3 4 E-TP-dNTP PPi E-TPn+1-PPi E-TPn+1  Polymerases undergo 4 significant conformational changes: During DNA binding step Subsequent to dNTP binding step and immediately preceding chemical catalysis Subsequent to nucleotide incorporation during PPi release During translocation towards new primer 3’-OH terminus Así, y a modo de introducción, las polimerasas sufren 4 cambios conformacionales significativos: Durante la unión a DNA (lo que posteriormente le llamaremos “grip”) El paso siguiente a la unión de dNTP e inmediantamente antes de la catálisis química (abierto-cerrado) Como consecuencia de la incorporación del nucleótido durante la liberación del pirofosfato Durante la translocación hacia el nuevo extremo 3’-OH del siguiente nt. Diferentes estudios indican que estos múltiples cambios conformacionales contribuyen a la fidelidad de la catálisis por las ADN polimerasas.

29 First step: polymerase binds to template
Region 1 Template El primer paso en la polimerización involucra la asociación de la polimerasa con el DNA molde (template-primer). Comparaciones entre estructuras cristalográficas de Taq poli I, Bst Pol I y E.Coli pol I en complejo con el ADN muestran que el dominio pulgar cambia la conformacion hasta practicamente envolver el ADN. Dos cambios conformacionales ocurren en el dominio pulgar de la TAQ Pol I. El dominio pulgar rota hacia el dominio de palma Los aminoácidos conservados localizados en la punta del dominio pulgar (región 1) rotan en una dirección opuesta al resto del pulgar de tal forma que la punta del pulgar se encuentre en proximidad al ADN (Es casi como si la polimerasa le clavara la uña del dedo pulgar al surco menor del DNA para sujetarlo). Concretamente en esta imagen sacada del pdb 2ktq podemos ver representado en verde el template y como la región 1 (color rojo) del dominio pulgar se encuentra próximo al ADN y por consiguiente aprieta el ADN a través del surco menor. Es importante destacar que este paso es el primero de la interacción con el DNA, la polimerasa se encuentra en conformación abierta... PDB: 2KTQ

30 Open conformation DNA 1 REGION 1 PDB: 2KTQ 2.40 Å 3.21 Å
1st step: conformational change in the tip of the thumb to grip DNA. La DNA polimerasa interacciona al principio través de del surco menor con la porción azúcar-fosfato del ADN , provocando a continuacion una curvatura del ADN de tal manera que adopta una conformación en forma de S. Estas interacciones no sólo contribuyen a la curvatura del ADN, sino que también tiene lugar una segunda serie de interacciones entre la región 2 localizada en la palma y el ADN cerca del surco menor. En est imagen podemos ver representado en la parte superior la región 1 del dedo pulgar y como interacciona con el ADN concretamente por el surco menor. También podemos comprovar que las distancias que encontramos entre algunos de los aminoácidos de la región 1 y el adn se encuentran alrededor de 2.40 A y 3.21 A. QUE TIPO DE INTERACCIÓN DIGO?¿?¿?PUENTES DE HIDROGENO?¿?

31 Low dNTPs concentration
OPEN CONFORMATION 2 Tyr671 DCT Stacking interaction 3 1st base 2.40Å 2) En esta imagen, vemos como cuando la concentración de dNTPs es baja (conformación abierta) la Tyr 671 de la hélice O del motivo B, ocupa el lugar que correspondería a la primera base del DNA de la doble cadena. Este aminoácido de arriba (TYR671) vemos como está colocado siguiendo la misma orientación de las bases que se disponen en la parte inferior. Concretamente la tyr 671 establece una interación de apilamiento (stacking) con la primera base, aunque en el pdb sobre el que estuvimos trabajando este “apilamiento” no se aprecia con gran claridad, aunque hemos tratado de sacar la imagen más intuitiva. Esta interacción producida entre la Tyr y la base, hace que la primera pase se desplace haciendo un giro de 90º respecto al eje del resto de la hélice. (Por otra parte, el nuevo nucleótido que ha de unirse (en este caso una citosina, DCT = 2',3'-DIDEOXYCYTIDINE 5'-TRIPHOSPHATE), yace en un bolsillo hidrofóbico, donde se apila sobre el 1er`par de bases adyacente a la tyr 671. De momento no se producen interacciones de Watson Crick entre las bases porque el template se encuentra girado ) . 3) En la parte inferior de la diapositiva vemos otra perspectiva de la situación anterior, donde se ve mejor la interacción a una distancia de aproximadamente de 2.40 A de la porción trifosfato del DCT con ASP610 y ASP785 en la zona del bolsillo hidrofóbico 90º 1st base PDB: 2KTQ

32 DCT En esta imagen vemos el DCT en el bolsillo hidrofóbico, para encontrarlo, seleccionamos los resíduos hidrofóbicos , después los marcamos en amarillo y finalmente al ver sus nubes electrónica vimos como se forma la zona del bolsillo hidrofóbico, donde se encuentra el centro catalítico, que más tarde nos explicará Stephy. Por otra parte, el nuevo nucleótido que ha de unirse (en este caso una citosina, DCT = 2',3'-DIDEOXYCYTIDINE 5'-TRIPHOSPHATE), yace en un bolsillo hidrofóbico, donde se apila sobre el 1er`par de bases adyacente a la tyr 671. De momento no se producen interacciones de Watson Crick entre las bases… PDB: 2KTQ

33 When dNTPs concentration increases...
CLOSED CONFORMATION RMS: 0.75 Cuando la concentración de dNTPs aumenta se produce el cambio de conformación desde su conformación abierta a su conformación cerrada. En color lila tenemos representado la conformacion abierta y superpuesta a esta imagen tenemos la conformacion cerrada (color verde) (ests superposición se ha realizado mediante STAMPy nos ha salido un RMS=0,75). Si nos centramos en la imagen podemos ver que hay una zona en el dominio “dedos” que no se superpone correctamente (representada en puntos). Vamos a verla más de cerca…. Open conformation (2KTQ) Closed conformation (3KTQ)

34 40º O-helix 11-12 Å Open conformation (2ktq.pdb)
Closed conformation (3ktq.pdb) 40º 11-12 Å Al ver la imagen más de cerca, podemos apreciar que se ha producido un giro de 40º, la hélice O del motivo B se ha desplazado unos A hacia el dominio palmar, donde se encuentra el sitio catalítico. Este cambio conformacional, hace que el DNA quede prácticamente englobado, sujeto en el puño de la polimerasa, además conlleva el acercamiendo de los dNTPs hacia el centro catalítico, donde los aminoácidos que lo conforman ejercerán su función. Para estudiar el dominio abierto hemos utilizado el pdb 2ktq, mientras que para el cerrado el 3ktq... Cuando la concentración de nuevos dNTPs es elevada la polimerasa adopta una conformación cerrada. En esta conformación, tienen lugar los siguientes pasos: la base del template se encuentra girada >=90º en el eje de la hélice (ES GIRO DE VUELTA?¿?No es el giro de antes, se mantiene en el mismo estado). 2) Existe un apareamiento de bases de Watson y Crick con el nuevo nucleótido. 3) Phe 667 de la hélice O forma interacciones de staking con el nuevo dNTP. 4) El dominio de dedos cambia la conformación hasta practicamente engullir el nuevo sustrato nucleotidico.

35 Closed conformation O-helix Arg587 Arg659 His639 Lys663 Gln613 Tyr671
Asp610 O-helix Arg587 Tyr671 Asp785 Gln613 Lys663 Arg659 His639 Mediante esta diapo queremos reperentar aquellos aa que juegan un papel más relevante en este cambio conformacional y los procesos que le siguen. En primer lugar, resaltar la hélice O (color lila), que si recordamos lo que ha comentado Raquel, contiene el dominio B, que etsá muy conservado en diferentes especies de procariotas, su importancia deriva de las diferentes interacciones que establecen los aminoácidos que la conforman con la molécula de desoxnucleotidín trifosfato. Siguiendo a estos cambios conformacionales la base de los nuevos nucleótidos entrantes se empaquetan contra dos aminoácidos hidrofóbicos (Tyr671 y Phe667) localizados en el motivo B y la ribosa de los nucleótidos se empaquetan contra Ile614 y la porción alifática de glu615. De esta manera un bolsillo hidrofóbico rodea la base y la ribosa del nuevo nucleótido. La porción trifosfato cargada negativamente del dNTP, a continuación del cambio conformacional, interacciona con dos aminoacidos básicos cargados positivamente (Lys663 y Arg659) del motivo B. Dos cadenas laterales acídicas , Asp610 y Asp785 en el motivo A y C, respectivamente, también participan en interacciones mediadas por metal con la porción trifosfato. Así, el objetivo de estos cambios, acercar los dNTPs hacia los aminoácidos del centro catalitico (Asp610 y Asp785). A continuación, os explicaré cada interacción de forma más detallada. PDB: 3KTQ

36 Hydrophobic pocket Tyr671 Phe667 Tyr671 4.11Å PDB: 3KTQ
Las interacciones de staking ocurren inicialmente entre la Phe 667 con la base del nuevo dNTP. El dessarrollo de esta interacción de staking facilita el movimiento de la hélice O (motivo B) hacia aminoácidos del motivo A y desplaza la Tyr671 que permite al template girar >90º de vuelta al eje de la hélice. Durante este paso se produce el emparejamiento de Watson y Crick entre las bases. La distancia del stacking es de 4.11 amstrongs. PDB: 3KTQ

37 Hydrogen bonding dNTP Hydrogen bonds ~3Å PDB: 1QSS
Para que se de la unión del dNTP han de producirse 4 tipos de interacciones con el nuevo nucleótido: Puentes de hidrógeno . Interacciones electrostáticas Interacciones de staking Interacciones mediadas por metales Primero pasaremos a hablar de los puentes de hidrógeno. Si el nuevo nucléotido es complementario con la base, es decir, si se produce emparejamiento de Watson y Crick, se crean puentes de hidrógeno con la base del template, estabilizando el dNTP. En esta imagen podemos ver como las distancias existentes entre los diferentes emparejamientos de bases es de aprox 3 a. Hydrogen bonds PDB: 1QSS

38 Structure dNTP Pentose Base α γ β Triphosphate PDB: 1QSS
El segundo tipo de interacciones son las electrostáticas, pero antes de comenzar con ellas, vendría bien repasar un pequeño concepto sobre la estructura del dNTP. Está formado por la base (púrica o pirimidínica), la pentosa (en este caso desoxiribosa) y el trifosfato. Cabe destacar los tres fosfatos que forman el trifosfato son: el fosfato alfa que es el fosfato que se encuentra más cercano a la ribosa, el fosfato beta que se encuentra un poco más alejado y finalmente el fosfato gamma que es el que se encuentra más alejado de la ribosa. PDB: 1QSS

39 - + Electrostatic Interaction α- phosphate Arg587 5,6Å PDB: 1QSS
Respecto a las interacciones electrostáticas se producen entre las cadenas cargadas positivamente de ciertos aminoácidos de la DNA polimerasa con el grupo trifosfato del dntp que se encuentra cargado negativamente. Dentro de estas interacciones es simportante destacar que se diferencian entre las que interaccionan con el fosfato alfa, beta o gamma. Dentro de las que interaccionan con el fosfato alfa cabe destacar la Arg587, la cual se encuentra representada de color verde en la imagen. Podemos ver como se produce la interacción entre el nitrogeno representado en azul y el fosfato alfa (el mas cerca de la ribosa). Es interacción iónica puesto que la arg contiene carga positiva en el nitrógeno y el fosfato tiene deslocalizada la carga negativa entre los diferentes oxígenos. En este caso podemos observar que la distancia existente entre entre estos dos residuos es de aproximadamente 5,6ª. PDB: 1QSS

40 + - Electrostatic Interaction Gln613 4,07Å PDB: 1QSS β phosphate
El segunto tipo de interacciones elctrostáticas, sería aquel en el que la interacción se produce con el fosfato beta. De este tipo es la interacción que se establece entre la Gln613 (glutamina) y el fosfato beta del dNTP. Como vemos mediante la representación de las nubes electrónicas, se produce una deslocalización de la carga de los oxígenos de los fosfatos (carga negativa) que realiza interaccion eslectrostáticas con la carga positiva del nitrogeno en azul. La distancia existente es de 4.07ª.

41 + - Electrostatic Interaction Lys663 PDB: 1QSS 5,02Å β phosphate Β-
En esta imagen podemos ver la Lys 663 que tambien realiza interacciones electrostáticas con los fosfatos del dNTP, en este caso con el fosfato beta. En este caso la distancia existente entre la interacción es de 5.02ª.

42 + - Electrostatic Interaction His639 ~5Å γ phosphate PDB: 1QSS
Finalmente destacaremos los aminoácidos que interaccionan con el fosfato gamma, es decir el que se encuentra más alejado de la ribosa. En la imagen podemos ver la His639 (N del anillo cíclico) que realiza interacciones electrostáticas con este fosfato con carga negativa deslocalizada. Azul: nitrógeno (carga positiva) Rojo: Oxígeno del fosfato... Estas interacciones van a facilitar la estabilización del dNTP para que puedan producirse los enlaces de hidrógeno entre las bases y también la posterior formación del enlace fosfodiéster, que tendrá lugar en el centro catalítico. PDB: 1QSS

43 + - Electrostatic Interaction Arg659 γ phosphate PDB: 1QSS 2,45 Å
En etsa imagen podemos ver como se produce la interaccion entre la carga positiva de la Arg 659 (nitrogeno) y la carga negativa de fosfato gamma. En este caso la distancia existente es de 2.45ª. PDB: 1QSS

44 Stacking interactions
Phe667 Tyr671 3,19Å 4,23Å Base Como última interacción de resíduos con el dNTP, que facilitan su estabilización para que pueda darse la formación del enlace, tenemos las interacciones de apilamiento (staking). Estas interacciones se producen entre algunos aminoacidos del motivo B de la dna polimerasa y la base del dntp. En la parte izquierda se encuentra representada en la parte más izquierda la Phe667 localizada en el motivo B y en la derecha la Tyr671. Las distancias existentes entre estos residuos y la base son de 4,23ª para el caso de la phe667 y 3,19 para la tirosina671. Además, comentar, que también se producen interacciones de apilamiento entre las bases del DNA, y que es una de las fuerzas que colaboran en su estabilización. Este interacciones de apilamiento de bases, ayudan a formar el ya mencionado bolsillo hidrofóbico, cuyo papel es muy relevante, ya que rodea las porciones de la base y la ribosa del dNTP y contribuye a la fidelidad de apareamiento de bases de la polimerasa al formar un bolsillo que permite al enzima reconocer la forma del nuevo par de bases entrante, antes de que se produzca el paso de incorporación del nucleótido. PDB: 1QSS

45 Metal-mediated interactions
triphosphate Mg Asp785 Por último, cabe destacar otro tipo de interación, también implicada en facilitar la interacción del dNTP con el centro activo. Se trata de una interaccion mediada por metales entre la Asp610 del motivo A y la Asp785 del motivo C las cuales forman parte del centro catalítico con el grupo trifosfato del dNTP. En la imagen de la izquierda se muestra una visión trasera del centro catalítico, para señalar la posición del ASP610 que permite la interaccion con el dntp, En la imagen de la derecha, se muestra el ASP785, ambos forman parte del centro catalítico. Pero no voy a profuncizar más en el mecanismo, dando paso a Stephi, que lo explicará con mayor detenimiento. Asp610 Catalytic site PDB: 3KTQ

46 3 active site carboxylates
Taq polymerase: Active site Catalytic Triad: 3 active site carboxylates Motif A Asp610 Motif C Asp 785 Glu 786 GLU 786 ASP 785 Equivalence in Escherichia coli: Asp 705 Glu 710 Asp 882 Glu 883 El centro catalítico de diversas DNA polimerasas está constituido por carboxilatos de las cadenas laterales de tres residuos aminoacídicos, aspartato 610, aspartato 785 y glutamato 786, en el caso de la Taq pol. Podemos observar que tienen sus respectivos equivalentes en E. coli. Pero la diferencia radica en el hecho de que , la E. coli, al tener dos Glu esenciales en su centro activo, puede formar 2 triadas funcionales; aunque aún no se han podido definir las circunstancias en las que utiliza una u otra. ASP 610 2 viable triads!! PDB: 3KTQ 46

47 Taq polymerase: Active site
Mg A Catalytic Triad: Mg B La descripción del centro activo la basaremos en la Taq pol, como hemos venido haciendo en parte de la presentación. En el centro activo del enzima, ambos aspartatos interaccionan con dos iones, el magnesio A y el B. PDB: 3KTQ 47

48 Taq polymerase: Active site
Coordination of the Mg B Pα Pβ Pγ En la presente diapositiva, se pueden diferenciar los tres fosfatos del dNTP, La triada catalítica y los dos iones metálicos. En la forma cerrada del enzima, el dNTP se encuentra ubicado cerca de la triada catalítica, lo que hace suponer que es el paso de la forma abierta a la cerrada, cambio conformacional que afecta a la hélice O, lo que posibilitaría el acercamiento del dNTP y el establecimiento de la maquinaria enzimática funcional. Cada uno de los Mg++ constituye un complejo de coordinación octaédrico respecto al dNTP, un ddCTP, en este caso, y los carboxilatos del centro activo. Tyr 611 Asp 785 Asp 610 PDB: 3KTQ 48

49 Taq pol : Active site Coordination of the Mg B PO4β PO4α PO4γ Asp 785
Tyr 611 Asp 610 Asp 785 PO4γ PO4β Coordination of the Mg B PO4α Uno de los iones está ligado en el plano basal del octaedro a 4 átomos de oxígeno, dos de los fostatos beta y gamma y 2 de los aspartatos 610  y 785. La esfera de coordinación del ión se completa a cada lado del plano del octaedro por interacciones con los átomos de oxígeno del fosfato alfa y el carbonilo de la tirosina 611. PDB: 3KTQ 49

50 Taq pol : Active site Coordination of the Mg A OH2O O- O- 3’OH- PO4 α
Asp 785 PO4 α MgA Coordination of the Mg A Asp 610 O- 3’OH- A su vez, el otro ión de magnesio está coordinado en el plano con los 4 oxígenos, uno del carboxilato del Asp 785 y otro del fosfato alfa del nucleótido a añadir, además de 2 moléculas de agua. A un lado del plano octaédrico, este mismo magnesio se liga al oxígeno del carboxilato presente en el Asp 610. Sin embargo, en la otra cara del plano, hay una posición vacante que corresponde al hidroxilo 3' del extremo del DNA molde. De esta manera, el Mg A ión se encargaría de reducir la afinidad del hidroxilo por el hidrógeno, facilitando el ataque nucleofílico sobre el fosfato alfa. Mientras que el papel del primer ión magnesio que hemos descrito es permitir la salida del pirofosfato, tras lo cual, el enzima adopta la forma abierta, el DNA es traslocado para “leer” la siguiente posición y se libera el PPi. PDB: 3KTQ 50

51 Distance between atoms
Asp 610 Asp 785 Tyr 611 Pa Pb Pg MgA 3 2,77 3,2 5,29 2,86 2,09 3,04 3,14 2,85 4,38 2,12 4,61 3,24 2,24 3,4 3,53 2,39 3,54 2,214 2,228 Asp 610 Asp 785 HOH3003 HOH3125 Pa 3'OH MgB 3,85 3,4 3,73 3,2 ? 2,37 4,84 3,62 2.81 2,48 3,65 3,02 2,54 4,312 2,2 2,24 3,78  MgA  Los dos iones de Mg++ se encuentran separados 3.8 A entre si, y cada ligando, a su vez, a 2.2 A de los iones metálicos. 51

52 Taq pol : Active site Coordination of the Mg A: Distances PDB: 3KTQ
En esta diapo se pueden ver las distancias de forma más gráfica… 2.2 A PDB: 3KTQ 52

53 Structural Superposition
Polymerases I from Thermus aquaticus, E. Coli, B. Stearothermofilus and Bateriophage T7 Por otro lado, hemos leído diversos artículos que hacen referencia al elevado grado de conservación de la estructura tridimensional de muchas de las polimerasas. Para corroborarlo, superpusimos las polimerasas I de T. aquaticus, E. coli, B. stearothermofilus y el fago T7 y obtuvimos tal score y tal RMSD, confirmando la información que encontramos. Aunque hemos de mencionar que este score se incrementaba, de la misma forma, que se reducía el RMSD cuando se retiraba la secuencia del fago de la superposición. Cluster:  (1T7P_phage  & 3KTQ_Taq 1D8Y_KF 1XWL_Bst) Sc  7.04 RMS   2.28 PDB: 3KTQ, 1D8Y,1XLW, 1T7P 53

54 Structural Superposition
Este es el alineamiento realizado con el stamp avanzado. Nuestra intención era alinear al máximo las secuencias del bacillo, la taq y el fragmento Klenow, a pesar de que el alineamiento inicial con el stamp no nos diese low scores, ya que habían regiones más largas en el Bacillus, respecto a las otras dos bacterias. Podemos observar con claridad, cómo los dominios están claramente conservados en estructura y como hemos comentado antes, esto se extiende incluso a la secuencia. Score = 7, RMSD=1,86 *alignfit PDB: 3KTQ, 1D8Y,1XLW 54

55 Evolution within the same genus
El grado de conservación de la secuencia, es tal que se puede secuenciar el gen polA de la polimerasa I en individuos de la misma especie, pero de áreas geográficas distintas y se puede ver que las diferencias son mínimas. Incluso, al analizar individuos de especies distintas dentro del mismo género, se observa un elevado grado de identidad entre secuencias, sobretodo a nivel del centro activo. Esto sugiere que la taza de evolución de las polimerasas es baja. Esto se contradice con la elevada plasticidad de secuencia presente en los dominios del centro activo, salvo determinados aminoácidos críticos para la función enzimática, el resto son sustituíbles dentro de un margen de restricción. Se ha propuesto que sean los mecanismos de transferencia genética como la conjugación los que resuelvan esta contradicción. Así, se podría mantener una secuencia homogénea, al superar con éxito periodos adversos para la supervivencia, en los cuales se daría lugar a mutaciones adaptativas a revertir posteriormente, dado que la funcionalidad enzimática wild type es óptima. 55

56 Evolution among eukaryotic organisms
Esta última diapositiva, es sólo una confirmación de lo hasta ahora afirmado… Hemos comparado eucariotas superiores con eucariotas unicelulares y existe un grado de conservación de secuencias relevante, incluso comparando también con secuencias procariotas. Al hacer El hmm para buscar homólogos, encontramos diferentes secuencias; pero lo que nos llamó la atención, fue que de las eucariotas, las polimerasas eran mitocondriales. Algo coherente si tomamos en cuenta la teoría endosimbiótica. Hubiese sido interesante poder llevar estas conclusiones a un plano gráfico, pero no encontramos los pdbsnecesarios para hacerlo. 56

57 Conclusions These enzimes have a characteristic structure, similar to a hand with 3 differentiated domains: palm, fingers and thumb. Distinct conformational changes lead to the appropriate DNA sinthesis pathway. The active site is the most conserved part of the sequence and its mechanism is based on metal coordination complexes. In other enzimes with polymerase activity, like RT, the 3D-disposition and sequence are different, but similar mechanisms have been kept. Structure and sequence are highly and significantly conserved among some polymerases, determining its importance in different organisms.

58 Preguntas tipo PEM Pregunta 1
Señale la respuesta FALSA, referente a las familias de DNA polimerasas: La DNA polimerasa I procariota forma parte de la familia UmuC/DinB b) La familia RT contiene las retrotranscriptasas de los retrovirus c) Los miembros de la familia X funcionan durante la reparación del DNA d) La familia Pol III contiene la mayoría de DNA polimerasas bacterianas e) Existen 6 familias de DNA polimerasas

59 Preguntas tipo PEM Pregunta 2
¿Qué dominio/s de la DNA polimerasa I de E. coli constituye/n el fragmento Klenow? Dominio polimerasa b) Dominio 3’-5’ exonucleasa c) Los dos anteriores d) Dominio 5’-3’ exonucleasa e) Todos los anteriores

60 Preguntas tipo PEM Pregunta 3
Señale la respuesta VERDADERA, en relación a la topología de los dominios del fragmento Klenow: El dominio grande es del tipo α+β b) El dominio pequeño es del tipo α/β c) Las dos anteriores d) La lámina β mixta del dominio pequeño constituye una topología única e) Todas las anteriores

61 Preguntas tipo PEM Pregunta 4
Respecto a la vía de síntesis de DNA, ¿qué paso/s es/son limitante/s en la reacción? Unión de la polimerasa al cebador molde (template primer) de DNA 2. Cambio conformacional de la polimerasa, previo a la incorporación de dNTPs 3. Liberación de pirofosfato (PPi) 4. Formación del enlace fosfodiéster 1, 2 y 3 1 y 3 2 y 4 4 1, 2, 3 y 4

62 Preguntas tipo PEM Pregunta 5
Señale la respuesta FALSA, referente al fragmento klenow de la DNA polimerasa I: El fragmento klenow se encuentra en la región N terminal de la DNA polimerasa I. b) El fragmento klenow contiene el dominio exonucleasa 3’-5’ y el dominio con actividad polimerasa. c) El dominio con actividad polimerasa tiene una morfología similar a una mano derecha con tres dominios bien diferenciados: palma, pulgar y dedos. d) Cuando hablamos de la Taq polimerasa I, el fragmento klenow pasa a denominarse fragmento klentaq. e) El dominio palma es el más conservado.

63 Preguntas tipo PEM Pregunta 6
Sobre la estructura de la DNA polimerasa I, señala la respuesta VERDADERA: El dominio 5’-3’ exonucleasa tiene una estructura típica de barril beta y se encuentra englobado en el dominio pulgar. b) El dominio 5’-3’ exonucleasa se compone de dos dominios: un dominio N terminal tipo resolvasa, y otro dominio C terminal con un plegamiento tipo SAM. c) Los dominios palma, pulgar y dedos no son relevantes en la interacción con el DNA y por tanto no participan en la reacción de formación del enlace fosfodiéster. d) El dominio 3’-5’ exonucleasa del fragmento klenow no está formado por ninguna lámina beta. e) El dominio pulgar del fragmento klenow presenta un plegamiento tipo sándwich de dos capas.

64 Preguntas tipo PEM Pregunta 7
Sobre las regiones conservadas de la DNA pol, señala la respuesta VERDADERA: Las regiones más conservadas son los dominios A, B y C. b) El dominio A contiene la Asp610, que juega un papel importante en la interacción con el DNA. c) Las dos anteriores son ciertas. d) Algunos aminoácidos del motivo B y del motivo C tienen un papel muy importante en la estabilización del dNTP entrante. e) Todas las anteriores son ciertas.

65 Preguntas tipo PEM Pregunta 8
Respecto a la conformación abierta de la DNA polimerasa señala la respuesta FALSA: La Tyr671 del dominio dedos ocupa el lugar que correspondería a la primera base del DNA. La Tyr671 establece puentes de hidrógeno con la primera base del DNA. La primera base del DNA experimenta un giro de 90º respecto al eje de la hélice. El dNTP se apila sobre el primer par de bases adyacente a la Tyr671.

66 Preguntas tipo PEM Pregunta 9
¿En qué mecanismo se basa el centro activo de una DNA-polimerasa? En un complejo de coordinación octahédrico en torno a iones metálicos divalentes. En una coordinación octagonal entre residuos de la polimerasa y dos átomos de Mg++. En la unión covalente con el sustrato, en este caso el DNA. En una interacción forzada con el sustrato mediada por puentes salinos. Ninguna de las anteriores.

67 Preguntas tipo PEM Pregunta 10
¿Por qué se caracterizan evolutivamente las DNA-polimerasas? Por el grado de conservación estructural de los dominios A, B y C del centro activo y por su mecanismo de acción. Por la elevada identidad de secuencia y conservación estructural de los dominios A, B y C del centro activo y por su mecanismo de acción. Por el grado de conservación de secuencia de los dominios A, B y C del centro activo y por su mecanismo de acción. Por adoptar una conformación espacial fija, gracias a la presencia de residuos hidrofóbicos en el bolsillo catalítico. No se han hallado evidencias de que estos enzimas estén relacionados entre sí evolutivamente.