Juan Manuel Debernardi RT-qPCR: uso de rutina DISEÑO, EJECUCIÓN Y REPORTE DE EXPERIMENTOS DE RETROTRANSCRIPCIÓN SEGUIDA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA.

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1 Juan Manuel Debernardi RT-qPCR: uso de rutina DISEÑO, EJECUCIÓN Y REPORTE DE EXPERIMENTOS DE RETROTRANSCRIPCIÓN SEGUIDA DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL (RT QPCR)

2 Control de la expresión génica por miARNs en plantas Modelo de trabajo: Arabidopsis thaliana

3 Sistema regulatorio miR396 – GRFs (Growth Regulating Factors)

4 La RT-qPCR es una técnica cuantitativa sometida a múltiples etapas donde se puede introducir error. 1) Obtener el ARN de la muestra a analizar. Colecta del material Purificación del ARN 2) Tratamiento con DNAsa para eliminar el ADN genómico. 3) Retro Transcripción. 4) Real-time PCR. Protocolos para RT-qPCR establecidos  Que etapas son críticas Problemas comunes: Gran dispersión en los valores de Ct: Falta de reproducibilidad en replicas técnicas y biológicas. Tubos donde no hay amplificación Contaminaciones Amplificación del gen PP2A (calibrador) Como realizar una buena RT-qPCR

5 El procedimiento de extracción y purificación debe permitir obtener el ARN total en las siguientes condiciones: No degradado. Libre de nucleasas. Libre de ADN genómico. Libre de proteínas. Libre de inhibifores enzimáticos, para reacciones de RT y PCR. Libre de Mg2+ or Mn2+. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Obtener el ARN de la muestra a analizar Obtener el ARN Colecta del material Purificación del ARN

6 1) Cuanto material necesito para la RT? Para una RT-qPCR es suficiente con poco material (≈50mg) 2) Cómo hago la colecta?. Colecta en hielo – procesado de tejido fresco. + comodidad, - estabilidad de la muestra (contenido de agua de la misma).. Colecta directamente en N 2. + estabilidad de la muestra, - comodidad. OJO: Efectos de la congelación de tejido / descongelación sobre la calidad del ARN. Colecta en RNAlater. +estabilidad de la muestra, + comodidad, - costo. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Colecta del material Obtener el ARN de la muestra a analizar Obtener el ARN

7 . Métodos comerciales basados en purificación en columna con filtros de Silica-fibra de vidrio. RNeasy Mini Kit (Qiagen) GeneJET™ RNA Purification Kit (Fermentas). PureLink® RNA Mini Kit (Ambion) mirVana™ Kit(Ambion). Métodos basados en extracción química: One-step sample homogenization/lysis procedure with a phenol-based guanidinium solution (Chomczynski, 1987). Trizol, Tripure. Durante la homogeneización de la muestra, mantiene la integridad del ARN debido a la inhibición altamente eficaz de la actividad RNasa mientras disgrega las células y disuelve los componentes celulares. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Obtener el ARN

8 I) Homogenización: a.- Morterear el material en N 2 en el eppendorf con pilón (previamente enfriado). b.- Agregar 1 ml de Trizol para un máximo de 100 mg de tejido. Importante: una cantidad insuficiente de reactivo resulta en contaminación con ADN y proteina (<260/280). En este punto se puede conservar el homogenado a -80 °C hasta 1 mes. c.- Centrifugar a 12000 g a 4 °C 10 minutos y transferir el homogenado a un nuevo tubo. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

9 II)Separación: d.- Agregar 200 μl de cloroformo por cada ml de reactivo original, invertir vigorosamente por 15 seg, y centrifugar a 12000 g a 4 °C 15 minutos. e.- Pasar la fase superior a un nuevo tubo. El volumen de la fase acuosa representa ≈ 50% del volumen utilizado para la homogenización. Importante: evitar tomar de la interfase o de la fase orgánica (<260/280 y <260/230). Para estar seguro tomo 350 μl. Se generan 3 fases, la inferior (fenol/cloroformo), la interfase, y la fase superior acuosa que contiene el RNA. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

10 III) Precipitación del RNA: Existen diferentes protocolos de precipitación dependiendo de la calidad del ARN que deseamos. f.-Para precipitar ARN total (ARNm, ARNr, ARN pequeños): Agregar un volumen igual de isopropanol, en este caso 350 μl e incubar 2hr a - 20°C (OL). Dado que la precipitación de los ARNs pequeños depende fuertemente de las condiciones, es importante mantener esta relación. g.- Centrifugar 12000 g a 4 °C 10 minutos, descartar el sobrenadante. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

11 IV) Lavado: h.- Agregar 1 ml de etanol 70-80 %, frío, vortexear y centrifugar 7500 g a 4 °C 5 minutos. i.- Descartar el SN. Repetir el lavado con etanol y centrifugación. Descartar SN. V) Disolución del RNA: j.- Secar el pellet en estufa 37 °C por 10 min y resuspender en agua (calidad ARN). No dejar el pellet secar completamente. DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN

12 Medida de la concentración del RNA por espectrofotómetro UV a 260nm.. Relación 260/280≥ 2. Contaminación con proteína. Cantidad de reactivo ( trizol, tripure ) y toma de fase acuosa.. Relación 260/230. Microarrays se tolera hasta 1,5, y en RT-qPCR hasta 1. Contaminación con tiocianto de guanidinio Toma de fase acuosa. Chequeo de la integridad del RNA. 5 ug de ARN en 20 ul finales. Calentar 5 min a 65°C para romper estructura secundaria.. Llevar rápidamente a hielo y correr un gel de agarosa al 1,5 %. Relación 28S:18S debería estar entre 1.8 and 2.0, con baja cantidad de fragmentos chicos. Purificación del ARN Obtener el ARN de la muestra a analizar Métodos basados en extracción química: Trizol, Tripure Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR

13 - Condición de reacción (Vf:20 μl; completar con agua):. Buffer DNasa 2 μl. DNasa (Promega) 1 μl. ARN (0,5 a 1ug) Esta cantidad es suficiente y ayuda a no arrastrar potenciales impurezas que inhiban la RT. Punto importante para tener baja dispersión en valores de Ct en la qPCR. Hacer dilución del ARN llevando a aproximadamente 100ng/ul. (pipeteo entre 5-10 μl utilizando una p20) La idea es no tomar volúmenes chicos que introducen mucha variación. Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Tratamiento del ARN con DNAsa – Etapa crítica No existe método de purificación que permita obtener ARN completamente libre de ADN genómico.

14 Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR -Incubar 30 minutos a 37 °C Controles para evitar contaminaciones con productos de qPCR previas. A partir de este punto lo ideal es continuar en todos los pasos con un juego de pipetas exclusivas de RT-qPCR o utilizar tips con filtro. - Agregar 1 μl de “DNasa Stop Solution (EDTA)” e incubar 10 minutos a 65 °C. Si no se remueven los cationes divalentes el ARN se degrada al calentarlo en las etapas posteriores de la RT. Tratamiento del ARN con DNAsa – Etapa crítica

15 a.- Preparar la siguiente mezcla:. Oligo(dTV) 0,5 μg/μl 0,5 μl (oligo especifico, SLO, etc). dNTP mix 10 mM 1 μl. Agua csp 13,5 μl ARN (tratado con DNAsa)10 μl (precisión en el pipeteo) b.- Calentar a 65 °C durante 5 minutos e incubar en hielo al menos 1 minuto. c.- Spin down e.- Preparar la siguiente mezcla: 5X First Strand Buffer 4 μl DTT 0,1 M 1 μl Inhibidor de RNasa (Invitrogen) 1 μl SuperScript III 0,5 μl Agregar la mezcla al ARN y mezclar por inversión de los tubos. f.- Incubar 60 minutos a 50 °C e inactivar la reacción 15 minutos a 70 °C Síntesis del ADNc – Retro transcripción Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Siempre que se pueda, preparar mix. Evitar mezclar por pipeteo. Si es posible trabajar con un juego de pipetas y reactivos exclusivos de RT-qPCR.

16 a.- Realizar una dilución 1/10 de cDNA. (precisión en el pipeteo, evitar hacer la dilución con volúmenes chicos de cDNA, preferentemente usar > 5-10ul) Convenientemente preparar solo la cantidad necesaria para el experimento. El resto guardar a -20°C. b.- Realizar diluciones de los oligos que se van a utilizar. Prepara una mezcla 5μM del par de oligos, mezclando 10ul de cada uno (100μM) con 180 ul de agua. Real-Time PCR Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Diseño de los oligos y condiciones de la PCR. Evitar mezclar por pipeteo. Si es posible trabajar con un juego de pipetas y reactivos exclusivas de RT-qPCR. Trabajar rápido – Protocolo de pipeteo.

17 c.- Preparar la siguiente mezcla y alicuotar en tubos: Agua6,5 μl Buffer 10X2 μl Cl 2 Mg 50mM1,2 μl dNTPs 10mM0,4 μl SYBR green 10X0,8 μl Platinum-Taq0,1 μl Mezclar bien por inversión d.- Agregar en las paredes del tubo: cDNA5 μl, este volumen ayudar a reducir el error Mezcla Oligos 5μM4 μl Cerrar los tubos y dar un spin. Real-Time PCR Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR Diseño de los oligos y condiciones de la PCR. Evitar mezclar por pipeteo. Si es posible trabajar con un juego de pipetas y reactivos exclusivas de RT-qPCR. Trabajar rápido – Protocolo de pipeteo. Evitar sembrar los productos de las PCR en el mismo laboratorio

18 Obtener el ARN DNAsa Retro transcripción Real-time PCR ProblemaError común Degradación Abs 260/280 < 2 Abs 260/230 < 1 No amplificación Imprecisión en el pipeteoDispersión en los valores de ct Imprecisión en el pipeteoDispersión en los valores de ct Reactivos/pipetas contaminadosAmplificación en controles negativos Imprecisión en el pipeteoDispersión en los valores de ct Reactivos/pipetas contaminadosAmplificación en controles negativos Mezcla de la mixDispersión en los valores de ct Resumen

19 Ejemplo. Amplificación del gen PP2A Problemas en amplificación Dispersión en los valores de ct

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