Mutaciones Cap 16 (16.1-16.2) Slides 1-36 Asignadas Slides 37-44 Biol 3306 – Lab Genética JA Cardé, PhD UPRAg Verano 2014 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

Objetivos Al completar la discusión de esta presentación los estudiantes podrán: Explicar lo que es una mutación y los distintos tipos de mutaciones Mencionar las consecuencias de una mutación Mencionar las distintas causas de las mutaciones Explicar estrategias para probar agentes como mutagénicos. Analizar una autoradiografía para detectar una mutación.

INTRODUCCIÓN Mutacion: se referiere a un cambio heredable en el material genético proveen variaciones alélicas Por el lado positivo, son la base para cambios evolutivos, permitiendo a las especies adaptarse al ambiente (Ej:piel clara en latitudes polares) En el lado negativo, son mas perjudiciales que beneficiosas y muy a menudo causa de enfermedades Hemofilia Son un área activa de investigación. Como muchas son detrimentales se han desarrollado sistemas de reparación del DNA. Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

16.1 CONSECUENCES DE LAS MUTACIONES Se pueden dividir en tres tipos principales 1. Cromosomales Cambios en la estructura de los cromosomas 2. Genomicas Cambios en el número cromosomico 3. De Genes Cambios relativamente pequeños en la estructura del DNA que ocurren en un gen en particular

Mutaciones de Genes Cambian la Secuencia del DNA mutación de punto: cambio en un sólo par de bases Por ejemplo una sustitución de bases 5’ AACGCTAGATC 3’ 3’ TTGCGATCTAG 5’ 5’ AACGCGAGATC 3’ 3’ TTGCGCTCTAG 5’ transición un cambio de una pirimidina por otra (C, T) pirimidina o una purina (A, G) por otra purina transversión es un cambio de una pirimidina por una purina o viceversa Las transiciones son mas comunes que las transversiones Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Mutaciones de Genes Cambian la Secuencia del DNA Tambien involucran las deleciones o adiciones de secuencias cortas de DNA 5’ AACGCTAGATC 3’ 3’ TTGCGATCTAG 5’ 5’ AACGCTC 3’ 3’ TTGCGAG 5’ Deletion of four base pairs 5’ AACGCTAGATC 3’ 3’ TTGCGATCTAG 5’ 5’ AACAGTCGCTAGATC 3’ 3’ TTGTCAGCGATCTAG 5’ Addition of four base pairs Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Las Mutaciones de Genes Pueden Alterar la Secuencia Codificante dentro del Gene Mutaciones en la secuencia codificante de un gen estructural puede tener varios efectos en la proteína: Silenciosas: susituciones de bases que no alteran la secuencia de aminoácidos (AA) de un polipéptido Debido a que el código es degenerado Cambio de sentido: sustituciones de bases en donde cambia un aminoácido Ej: Sickle-cell anemia (Figura 16.1) Neutral: Si el AA sustituido no tiene efecto detectable en la función de la proteína. Esto puede ocurrir porque el nuevo AA tiene una química similar que el reemplazado. Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Figure 16.1 (a) Micrographs of red blood cells NORMAL SICKLE CELL Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. © Phototake/Alamy © Phototake/Alamy Normal red blood cells Sickled red blood cells 10 μm 10 μm (a) Micrographs of red blood cells NORMAL : NH2 – VALINE – HISTIDINE – LEUCINE – THREONINE – PROLINE – GLUTAMIC ACID – GLUTAMIC ACID... SICKLE CELL : NH2 – VALINE – HISTIDINE – LEUCINE – THREONINE – PROLINE – VALINE– GLUTAMIC ACID... (b) A comparison of the amino acid sequence between normal b-globin and sickle-cell b-globin Figure 16.1

Mutaciones de Genes Cambian la Secuencia del DNA Mutaciones en la secuencia codificante de un gen estructural puede tener varios efectos en la proteína: Sin sentido sustituciones de bases donde cambian un codón normal por uno de terminación De marco de lectura: Se dan por la adición o deleción de un número de nucleótidos que NO es divisible por tres Esto cambia el marco de lectura asi que la traducción del mRNA resulta en una secuencia de AA completamente diferente luego del punto de la mutación Tabla 16.1 – Resume las mutaciones Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Mutaciones de Genes fuera de la secuencia codificante pueden afectar el fenotipo Mutatciones en el promotor puede afectar el nivel de expresion del gen. Mutaciones de aumento de expresión Disminución de expresión. Tabla 16.2 otras mutaciones Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Mutaciones de Genes y sus Efectos en el Genotipo o Fenotipo wild-type (tipo salvaje): el genotipo prevalente en la poblacion natural. En alelos multiples pueden haber dos o mas WT Forward (prospectiva)- cambian el WT a una nueva variante Reverse (de reversión)- revierten un mutante al WT Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Tambien se describen en base a su efecto en el fenotipo WT Tambien se caracterizan por su habilidad diferencial para sobrevivir Detrimentales – disminuyen las probabilidades de sobrevivir l Letales las mas detrimentales (polidactilia homocigota en gatos) Beneficiosas – aumentan la supervivencia o exito reproductivo El ambiente puede determinar si una mutacion es D o B Algunas son condicionales Afectan el fenotipo solo bajo cierta condiciones EJ: mutaciones de sensitividad a temperaturas Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Hemingway Cats Polidactilia en gatos

La segunda mutacion ocurre en el mismo gen que la primera Una segunda mutación puede a veces afectar la expresión fenotípica de otra: Supresoras- mutaciones en un segundo lugar que afectan negativamente otra Intragénicas La segunda mutacion ocurre en el mismo gen que la primera intergénicas – La segunda mutación ocurre en un gen diferente al de la primera Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Cambios en la Estructura Cromosomal puede afectar la Expresión de un Gen Un rearreglo cromosomal puede afecta un gen porque se altere la continuidad El gen puede quedar intacto pero su expresión afectarse por su nueva localización Esto se conoce como efecto de posición Porque ocurre esto?: 1. Se mueve cerca de secuencias reguladoras Figure 16.2a 2. Se mueve a regiones de heterocromatina Figure 16.2b AND 16.3 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Regulatory sequences are often bidirectional Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Regulatory sequences are often bidirectional Coding sequence B B Core promoter Gene B Core promoter for gene A is moved next to regulatory sequence of gene B. A Regulatory sequence Inversion A Coding sequence Gene A Core promoter (a) Position effect due to regulatory sequences Active gene Gene is now inactive. Efecto de posicion Se mueve cerca de secuencias reguladoras Se mueve cerca de heterocromatina Translocation Heterochromatic chromosome (more compacted) Translocated heterochromatic chromosome Euchromatic chromosome Shortened euchromatic chromosome (b) Position effect due to translocation to a heterochromatic chromosome Figure 16.2-3

Mutaciones: pueden ocurrir en células Somáticas o Germinales Geneticistas clasifican las células en: Germinales Dan lugar a gametos: espermatozoides y ovulos y sus precursores Somáticas Todas las demás células del cuerpo Mutaciones de linea germinal: ocurren directametne en los gametos o en sus precursoras. Figure 16.4a Mutaciones somáticas: occuren directamente en una célula corporal o en precursoras de ellas Figure 16.4b AND 16.5 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Germ-line mutation Gametes Somatic mutation The size of the patch will depend on the timing of the mutation Embryo The earlier the mutation, the larger the patch An individual who has somatic regions that are genotypically different from each other is called a genetic mosaic Patch of affected area Mutation is found throughout the entire body. Mature individual Therefore, the mutation can be passed on to future generations Therefore, the mutation cannot be passed on to future generations Half of the gametes carry the mutation. None of the gametes carry the mutation. Figure 16.4 (a) Germ-line mutation (b) Somatic cell mutation

Ejemplos de mutaciones Somaticas: Muta una celula embrionica y todas las que salen de ella siguen con el rasgo EJ. Parcho blanco en el pelo Ojos con pigmentacion distinta

16.2 CAUSAS DE MUTACIONES Pueden ser espontáneas o inducidas Resultan de anormalidades en procesos celulares o biológicos Erores en replicación del DNA replication La causas principales estan en la célula Inducidas Causadas por factores ambientales Agentes mutagenos: causan mutaciones Agentes físicos o químicos Ver Tabla 16.4 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Espontáneas Recombinaciones aberrantes Segregaciones aberrantes Errores de replicación Transposones Depurinaciones Deaminaciones Tautomerimos Toxicidad Inducidas Químicas Físicas

Las espontáneas son eventos del azar Ocurren por casualidad o son provocadas por factores ambientales? Jean Baptiste Lamarck: Teoría de adaptación fisiológica Proponía que el uso y desuso determina que rasgos se pasan genéticamente Charles Darwin: Teoría de mutación aleatoria La variación genética ocurre por el azar La selección natural escoge las que mejor lo adaptan

Mutaciones al azar pueden conferir ventajas adaptativas Joshua y Ester Lederberg(1950s) diseñaron una estrategia para evaluar esto Estudian la resistencia de E. coli a la infeccion del bacteriofago T1 tonr (T one resistance) Hipotesis: célula de E. coli que sobrevivan a la infección de T1 eran ya resistentes antes de la exposición al fago Debido a mutaciones aleatorias "Replica plating” – técnica de replicar siembras

El experimento de Lederberg: Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Master plate containing many colonies that were grown in the absence of T1 phage A velvet cloth (wrapped over a cylinder) is pressed gently onto the master plate and then lifted. A little bit of each bacterial colony adheres to the velvet cloth, thereby creating a replica of the arrangement of colonies on the master plate. A few tonr colonies were observed at the same location on both plates!!! This indicates that mutations conferring tonr occurred randomly on the primary (nonselective plate) The presence of T1 in the secondary plates simply selected for previously occurring tonr mutants This supports the random mutation theory Velvet cloth The replica is then gently pressed onto 2 secondary plates that contain T1 phage. Petri plate with T1 phage Petri plate with T1 phage Incubate overnight to allow bacterial growth. Figure 16.7 Replica plating

Frecuencia de Mutaciones Frecuencia de mutación: la probabilidad de que un gen sea afectado por una nueva mutación Se expresa como el numero de mutaciones nuevas en un gen dado por generacion de celulas. Esta en el rango de 10-5 a 10-9 por generación La frecuencia de mutacion para un gen dado no es constante Puede ser aumentada por agentes mutagenicos Esta frecuencia varia entre especies y entre cepas o lineas de la misma especie

Mutation Rates and Frequencies En el mismo individuo algunos genes mutan mas que otros Genes mas grandes que otros Proveen mas oportunidades para mutar que los pequeños Localizaciones de algunos genes en el cromosoma los hacen mas propenso a mutar hot spots – regiones con mas tendencia a mutar Hot spot: pueden encontrarse en un mismo gen Bases específicas y regiones específicas mas propensas

Causas de mutaciones espontáneas Mutaciones espontáneas pueden surgir por tres mecanismos 1. Depurinación 2. Deaminación – por lo general de las C, resulta en U, si no se corrige: en lugar de C-G aparecerá U-A 3. Tautomerismo – cambio temporero en la estructura de la base, por migraciones de hidrogenos, pasan de AT/GC a TG/CA, es reversible pero si ocurred justo antes de replicación causa la mutación. The most common; We will focus here Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Causas de mutaciones espontáneas Depurinación: resulta de remoción de una purina (G/A) del DNA El enlace covalente enter la deoxiribosa y la purina es algo inestable Ocasionalmente reacciona espontáneamente con el agua y la base se suelta de la azucar Esto se conoce como un sitio apurinico Esos sitios apurinicos se pueden reparar, Cuando este sistema de reparacion falla, una mutacion puede resultar durante las rondas de replicacion Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

(b) Replication over an apurinic site Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 5′ 3′ 5′ 3′ C G C G A T A T T A Depurination T A Apurinic site C G C G C G C 3′ 5′ 3′ 5′ (a) Depurination 5′ 3′ G Three out of four (A, T and G) are the incorrect nucleotide C A T T A 5′ 3′ C G There’s a 75% chance of a mutation C G G C A T DNA replication 3′ 5′ T A C 5 3′ G C C G 3′ 5′ A T T A X could be A, T, G, or C X G C 3′ 5′ (b) Replication over an apurinic site Spontaneous depurination Figure 16.8

Mutaciones por Repeticiones de Trinucleótidos Trinucleotide repeat expansion (TNRE) The term refers to the phenomenon that a sequence of 3 nucleotides can increase from one generation to the next Causa para muchas condiciones severas Ejemplos Huntington disease (HD) Fragile X syndrome (FRAXA) Ver Tabla 16.5 para estas y otros ejemplos. Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Desórdenes por TNRE SBMA – Spinal and Bulbar Muscular Atrophy HD - Huntintong Disease SCA1 – Spinocerebellar Ataxia FRAXA(E) – Fragile X Syndromes DM - Myotonic Muscular Distrophy

Ciertas regiones del cromosoma contienen secuencias de trinucleotidos repetidas en tandas En individuos normales estas secuencias se transmiten a la progenie sin mutación En personas con el desorden TNRE, la longitud del trinucleótico se extiende mas alla de un tamaño crítico Causa sintomas de la condición Se siguen expandiendo Se conoce como repetición del trinucleótido CAG CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG n = 11 CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG n = 18 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Si la expansión es dentro de la secuencia codificante Si el trinucleotido repetido es CAG (glutamine) La proteina codificada tendrá extensiones de Glut corridas Las proteínas se agregan entre si Esto exhacerba los síntomas Si la expansión es fuera de la secuencia codificante Causan cambios en la estructura del mRNA Generan islas CpG que se asocian a silenciar genes Dos aspectos comunes: Progresión en severidad en generaciones (anticipación), depende de que padre pasa la herencia HD de padres mientras que MD de madres No se entienden por completo Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Tipos de agentes mutágenos Muchisimos agentes puede afectar el DNA La preocupación esta porque: 1. Los mutagenos por lo general estan involucrados en producir cancer 2. Mutagenos pueden generar cambios que se pasan a las siguientes generaciones Se clasifican en Físicos Químicos Ver Tabla 16.6 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Ejercicio Objetivo: Analizar una autoradiografia de una secuenciacion de DNA para detectar una mutación Comparar la secuencia deducida con la siguiente 5’AGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCGTAATCATGGT3’

Protocolo Obtener una autoradiografia y leerla segun el orden: GATC Comienza el analisis da abajo hacia arriba. Compara la secuencia deducida con la secuencia mostrada por el profesor. Identifica la localizacion del nucleotido mutante. Que tipo de mutacion es? Hay mas de una mutación? Cual es el efecto en los codones y AA codificados:

Protocolo BONO: Análisis de Blast 1. Identificar a quien pertenece la secuencia. 2. BLAST para comparar secuencias NCBI BLAST Specialized BLAST Align Comparar las dos secuencias: Identifica la homologia, parecido y señala lugares de cambios

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Mutagens Alter DNA Structure in Different Ways Chemical mutagens come into three main types 1. Base modifiers 2. Intercalating agents 3. Base analogues Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Base modifiers covalently modify the structure of a nucleotide For example, nitrous acid, replaces amino groups with keto groups (–NH2 to =O) This can change cytosine to uracil and adenine to hypoxanthine These modified bases do not pair with the appropriate nucleotides in the daughter strand during DNA replication Refer to Figure 16.15 Some chemical mutagens disrupt the appropriate pairing between nucleotides by alkylating bases within the DNA Examples: Nitrogen mustards and ethyl methanesulfonate (EMS) Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

These mispairings create mutations in the newly replicated strand Template strand After replication H H NH2 N H O H N H N HNO2 N N H N N Sugar O N N Sugar Sugar O H These mispairings create mutations in the newly replicated strand Cytosine Uracil Adenine H N H NH2 H N O H N H HNO2 N N N N H N H Sugar Sugar N N N H H O Sugar Adenine Hypoxanthine Cytosine Mispairing of modified bases Figure 16.15 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Intercalating agents contain flat planar structures that intercalate themselves into the double helix This distorts the helical structure When DNA containing these mutagens is replicated, the daughter strands may contain single-nucleotide additions and/or deletions resulting in frameshifts Examples: Acridine dyes Proflavin Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

This tautomeric shift occurs at a relatively high rate Base analogues become incorporated into daughter strands during DNA replication For example, 5-bromouracil is a thymine analogue It can be incorporated into DNA instead of thymine Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 5-bromouracil (keto form) Adenine Sugar H O N Br N 5-bromouracil (enol form) Guanine Sugar O Br H Mispairing This tautomeric shift occurs at a relatively high rate Normal pairing Figure 16.16 (a) Base pairing of 5BU with adenine or guanine Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

In this way, 5-bromouracil can promote a change of an AT base pair into a GC base pair Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. 5′ 3′ A T 5′ 3′ 5′ 3′ DNA replication 3′ 5′ G C A 5BU 5′ 3′ DNA replication 3′ 5′ 3′ 5′ G 5BU 5′ 3′ 3′ 5′ G or A 5BU 3′ 5′ (b) How 5BU causes a mutation in a base pair during DNA replication Figure 16.16 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Physical mutagens come into two main types 1. Ionizing radiation 2. Nonionizing radiation Ionizing radiation Includes X-rays and gamma rays Has short wavelength and high energy Can penetrate deeply into biological molecules Creates chemically reactive molecules termed free radicals Can cause Base deletions Oxidized bases Single nicks in DNA strands Cross-linking Chromosomal breaks Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Nonionizing radiation Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. H O Nonionizing radiation Includes UV light Has less energy Cannot penetrate deeply into biological molecules Causes the formation of cross-linked thymine dimers Thymine dimers may cause mutations when that DNA strand is replicated O N O O P O CH2 O O – N H H CH3 H H H H Thymine CH3 O H O O P O CH2 O O – N N H H H H H O H Thymine Ultraviolet light H O N O O O P O CH2 O O – N H H CH3 H H H H O CH3 H O O P O CH2 O O – N N Figure 16.17 H H H H H O H Thymine dimer Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display

Animations

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Referencias Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc. http://learn.genetics.utah.edu/content/variation/mutation/ http://www.brooklyn.cuny.edu/bc/ahp/BioInfo/MUT/Mut.Definition.html https://www.youtube.com/watch?v=eDbK0cxKKsk http://www.hgmd.org/