Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción. Tema 18. Condiciones de la actividad enzimática: Dependencia de la Temperatura y el pH. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción. 1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia. 1.2. Dependencia de la temperatura en reacciones enzimáticas Efecto del pH sobre la actividad enzimática Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo 4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato

1. Efecto de la Temperatura sobre la Velocidad de Reacción La velocidad de las reacciones químicas es fuertemente dependiente de la temperatura Según la mecanica estadística la “Energía cinética media” (Ec) de un conjunto de moléculas es función de la temperatura actual, T. * Si la reacción tiene lugar a una temperatura T1 ==> hay un grupo de moléculas con “energía suficiente” para reaccionar después de una colisión eficaz. * A una temperatura más elevada, T2, (T2 >T1), el número de moléculas con “energía suficiente” es mayor.

Ec  f(v) = ½ mv2 ≥ Ea Ec  f(T) La mínima energía que deben tener las moléculas para poder colisionar de manera efectiva, se denomina “Energía de activación” (Ea). -Según la Mecánica clásica: Ec  f(v) = ½ mv2 ≥ Ea -Por otro lado: Ec  f(T) v -> Ea Como se observa en la figura, a medida que aumenta la temperatura, aumenta el número de moléculas con energía suficiente (Ec > Ea), es decir, con velocidad suficiente, para colisionar eficientemente

* A partir de una serie de datos experimentales, Arrhenius observó que el ln de la cte de velocidad, lnk, era función lineal del inverso de la temperatura absoluta, 1/T, y propuso la siguiente relación matemática:

k = A  e- (Ea/RT) y = b - mx O en forma exponencial: Si representamos: lnk frente a 1/T, y = b - mx

* En la ec. de Arrhenius : k = A  e- (Ea/RT) A es una constante que tiene las mismas unidades que la constante de velocidad y representa la frecuencia de las colisiones eficaces entre las moléculas de los reactantes. R es la constante universal de los gases (8,315 J K-1 mol-1) T es la temperatura absoluta Ea es la llamada energía de activación de Arrhenius Energía debe suministrarse a las moléculas reaccionantes para obtener un choque eficaz. NOTA: Es conveniente tener en cuenta no es una deducción basada en una teoría preestablecida, sino que fue expresada a partir de observaciones experimentales, sin un modelo teórico previo.

Ea valor experimental 50-100 kJ/mol En el supuesto de que A y Ea sean independientes de la temperatura, podemos calcular la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, T1 y T2, que difieren en 10ºC. Aplicando logaritmos: A la razón de las dos constantes k1/k2 a dos temperaturas diferentes, suele denominársele Q10. Ea valor experimental 50-100 kJ/mol Q10 2 a 4 al variar 10 C Duplica o cuadriplica la velocidad de reacción cada 10 grados

- Continuemos considerando una reacción del tipo: S  P 1.1.Teoría de Arrhenius y la Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring: Equivalencia. - Continuemos considerando una reacción del tipo: S  P Aproximación experimental de Arrhenius Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring (TEMA 5) - Tomando ln de ambas ecuaciones tendremos:

Aproximación experimental de Arrhenius Derivando respecto de la temperatura, (Ea, DH# y DS# independientes de la temperatura) Aproximación experimental de Arrhenius Teoría de las velocidades absolutas de reacción de Eyring (TEMA 5) De donde, - Esta ecuación es muy útil, desde el punto de vista práctico, pues nos permite obtener el valor de la entalpía de activación, DH# Nota: el valor de Ea lo podemos calcular experimentalmente, a partir de la pendiente de la representación de lnk  1/T

La ecuación anterior nos permite calcular el valor de DS#. - Sustituyendo el valor DH# en la ecuación de Eyring: - Comparando esta ecuación con la de Arrhenius, se obtiene el siguiente valor para la constante A∞: Valor experimental La ecuación anterior nos permite calcular el valor de DS#.

Cálculo de la energía libre de Gibbs DG# a una T determinada Los valores de entalpía de activación, DH#, y de entropía de activación, DS#, son de una gran utilidad. Información sobre la naturaleza del estado de transición y del mecanismo de reacción. Cálculo de la energía libre de Gibbs DG# a una T determinada - El valor de DH#, generalmente es positivo, lo que significa que para formar el estado de transición deben tensionarse o distorsionarse algunos enlaces, consumiendo calor (energía). - Generalmente, un valor de entropía de activación, DS#, alto y negativo sugiere que en el estado de transición las moléculas que han reaccionado adoptan conformaciones mucho más ordenadas que las que tenían en el estado elemental.

[N] [D] 1.2. Dependencia de la temperatura reacciones enzimáticas Vmax función lineal de la [E] y de la kcat función lineal de la temperatura ?? Kcat es función de la temperatura (Ecuación de Eyring) Naturaleza proteica de las enzimas Procesos de desnaturalización [N] [D] Incremento de temperatura reacción enzimática 1. Aumento de la velocidad (reacción química) Ley de Arrhenius 2. Desnaturalización proteica

[N] [D] Vmax= kcat [N] [Eo] = [N] + [D] Equilibrio de desnaturalización: Constante de equilibrio Entalpia y Entropia estandar de desnaturalización de la enzima Ensayamos el efecto de la temperatura en condiciones de velocidad máxima Vmax= kcat [N] [Eo] = [N] + [D]

Vmax= kcat [N] Kcat y KD Función de la temperatura Temperaturas << KD es muy pequeña Varian según Arrehnius Vmax y la Kcat Tiende a 0 KD es grande Temperatura>>>> Temperaturas >Temperatura de transición 50% N y 50% D

Enzima de un cangrejo de alaska Quimiotripsina porcina Enzima Bacteria de Yellowstone Desnaturalización Comportamiento según Arrhenius Vmax Temperatura Temperatura Energía de activación y parametros termodinámicos de la reacción enzimática: Se obtienen en el rango de temperaturas donde no hay fenómenos de desnaturalización

Graficas de Arrhenius discontinuas: Cambios conformacionales asociados a la temperatura Ln Vmax 1/Tc 1/T Enzimas asociadas a membranas. Tc temperatura cambio de conformación de los fosfolipidos asociados a la proteína en la membrana

2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática Enzimas: Ácidas Neutras Alcalinas Vmax 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 pH pH pH pKa de aminoácidos que pueden estar implicados en el centro activo pKa -COOH 3,0-3,2 - -COOH 3,0-5,0 -imidazolio 5,5-7,0 -NH3 7,5-8,0 SH 8,0-8,5 Fenol 9,8-10,5 Guanidinio 11,6-12,6 Interior de la proteína pKa cambios de hasta 2 unidades

Modelo comportamiento de una enzima con dos residuos ionizables que interviene en el centro activo. K1 K2 + S Ks1 Ks2 kcat Substrato no ionizable en el rango de pH K1 y k2 constantes de disociación de los grupos protonizables Ks1 y Ks2 constantes de disociación de las diferentes especies químicas forman complejos la E y S Km constante de Micaelis de formación del único complejo que da el producto EH1-

Los diferentes complejos se expresan en función de [H+] y las contantes de disociación Valores de los distintos complejos Valor de la constante de Michaelis Sustituyendo y sacando factores comunes

De esta expresión tenemos que obtener el valor de A partir de la ecuación de balance de masas de la enzimas y el valor de Km

pH puede modificar tanto la Vmax como la Km Multiplicando y diviendo por la expresión Expresión general que representa el comportamiento de la velocidad de una enzima con dos restos aminoácidos protonizables y su forma activa es pH puede modificar tanto la Vmax como la Km

Presencia de Substrato no modifica los pKa de los grupos ionizables de la enzima No se modifica la Km sólo la Vmax A [S] saturantes f - Función de Michaelis Fracción de la enzima en la forma EH1- Da los productos de la reacción Valor entre 0 y 1

[H+]<<<K1 y [H+]>>>K2 Vmax no se modifica 1 [H+] muy altas ó muy bajas Vmax tiende a 0 0,5 pK1 pK2 Otras Formas activas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH 1 1 E= EH1H2 0,5 0,5 pK1 pK2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH pH

3. Deducción de los pKa de los aminoácidos del centro activo 1 0,5 pK1 A pH bajo pK2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH A pH alto Para el modelo enzima diprótica y en su forma EH1- Sólo pueden hacerse cuando la diferencia entre los dos pK sea al menos 3,5 unidades de pH de diferencia

Confirmados por otras técnicas: Linearización de la ecuación de la velocidad máxima en función de la variación de pH { } -log2 A pH bajos pK1 pK2 Se desprecia 1 como sumando y K2/[H+] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH A pH altos Se desprecia 1 como sumando y [H+]/K1 Confirmados por otras técnicas: Modificación química específica de aa, mutagenesis dirigida, etc

+ S K1 Cálculo del pKa para una Enzima monoprotica Km kcat 1/vpH -1/K1

Obtener el pKH + S So= S- + SH 4. Efecto del pH sobre la ionización del substrato Generalmente fenómenos poco frecuentes KH Sólo se ioniza el substrato + S Km So= S- + SH kcat Sólo varia la Km Obtener el pKH ¿Y si se ionizan tanto la enzima como el subtrato? Tarea

RESUMEN TEMPERATURA pH El calor aumenta la velocidad de las reacciones. Arrhenius descubrió experimentalmente la ley de dependencia de la constante de velocidad de una reacción con la temperatura. Para la mayoria de las reacciones químicas la constante de velocidad aumenta de 3,0 a 4,0 veces al aumentar 10° C la temperatura. Mediante la ecuación experimental de Arrhenius puede determinarse la Ea o energía de activación de Arrhenius, energía que ha de comunicarse a las moléculas para que tengan un choque eficaz. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen la ley de Arrhenius. La naturaleza proteica limita el calentamiento progresivo para aumentar la velocidad, pues se puede llegar a la desnaturalización de la proteína Experimentalmente, se obtiene Ea y a partir de ella se puede obtener el valor de los parámetros termodinácos de la reacción enzimática como la entalpia, entropía y energía libre de activación. pH Las enzimas ensayadas in vitro a diferentes pH se comportan como: enzimas ácidas, neutras y básicas. Las curvas de actividad enzimática frente a variaciones de pH puede darnos información sobre los pKa de los residuos de aminoácidos implicados en la catálisis. La función de Michaelis de las enzimas con residuos ionizables se ajustan muy bien a los comportamientos experimentales Cuando el substrato no influye en la ionización de la enzima, solamente la Vmax se verá afectada. En el caso de que sea solamente el substrato el que se ionice en el rango de pH estudiado, solamente se verá modificada la constante de Michaelis.