Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Detección de ácidos nucleicos Southern blot Northern blot Con hibridación Western blot FISH Microarray Detección de ácidos nucleicos PCR Con amplificación LCR NASBA, b-DNA

Métodos de amplificación de la diana PCR (y sus variantes) NASBA (Nucleic Acid Sequence based amplification) Métodos de amplificación de la sonda Reacción en cadena de la ligasa (LCR) Métodos de amplificación de la señal - Branched DNA (b-DNA)

Historia de la PCR Kary Mullis Diseñó la técnica de PCR en los años 80 Premio Nobel en Química, 1993

Técnica molecular específica, rápida, sensible y versátil ¿Qué es la PCR? Técnica molecular específica, rápida, sensible y versátil PCR A partir de una molécula de ADN se obtienen millones de copias de un mismo fragmento ¿Cómo es esto posible? ....

Pensemos en la naturaleza... ¿Cómo hace la célula para replicar su genoma? DOBLE CADENA DE ADN SE DESNATURALIZA LA DOBLE HEBRA SE SINTETIZAN 2 COPIAS IDÉNTICAS A LA DOBLE CADENA DE ADN SE UNE LA ENZIMA ADNpol

¿Cómo podemos lograrlo in vitro? PCR ¿Cómo podemos lograrlo in vitro? ADN polimerasa termoestable Molécula de ADN (molde) Cebador sentido Cebador Antisentido Cofactor Mg2+ dNTPs (A;G;T;C)

SECUENCIA QUE DESEO AMPLIFICAR ¿Qué es un primer? Secuencia de oligonucleótidos complementaria a secuencia de ADN que se desea amplificar Fragmento de ADN PRIMER REV SECUENCIA QUE DESEO AMPLIFICAR PRIMER FW Permite amplificar un fragmento específico a partir del genoma

Primers Cebador sentido (Primer Forward ) 5´ 3´ CACGGCCCTGGGAACAATGCAGCTCCGCGTGCGGGCTGAGAGGACCCTGCCCCACCCCAGGTTCCACGCTCA 3´ GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´ 5´ CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´ 3´ GTGCCGGGACCCTTGTTACGTCGAGGCGCACGCCCGACTCTCCTGGGACGGGGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´ Cebador sentido (Primer Forward ) 5´ CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´ Cebador antisentido (Primer reverse) 3´ GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´

Características ideales para un primer Longitud: entre 18 y 30 nucleótidos Contenido G+C entre 40-75% Carecer, en lo posible, de estructuras secundarias y de complementariedad entre sí Ambos primers deben tener temperatura de pegado similar. Cálculo de la temperatura de annealing: [2(AxT ) + 4(CxG)] - 5 Existen programas para diseñar primers y evaluar sus características

La ADN polimerasa Debe ser resistente a altas temperaturas: actúan ~72°C Existen varias: la más usada es la Taq obtenida de la bacteria Thermophilus aquaticus (enzima termoestable) Actividad exonucleasa 5´ 3´ Enzima se une con alta afinidad al ADN Necesita de primer o cebador para empezar la reacción Necesita de cofactores (Mg2+). Concentración tiene efecto en especificidad y rendimiento de reacción  baja concentración: bajo rendimiento, exceso: amplificaciones inespecíficas

Los desoxinucleótidos (dNTPs) GRUPO FOSFATO AZÚCAR BASE NITROGENADA Concentración afecta especificidad y fidelidad de reacción Concentraciones altas: disminuye fidelidad de polimerasa y puede inhibir su actividad.

Pasos de la PCR Desnaturalización Pegado del primer Extensión Repetición de ciclos Amplificación de fragmento determinado

Termocicladores

Pasos de la PCR Tres pasos básicos Desnaturalización Apareamiento Primers complementarios Apareamiento Elongación

PCR

Termociclador Reacción comienza a 94ºC: puentes de H que mantienen unidos a la doble hebra se rompen  ADN molde se desnaturaliza (moléculas simple cadena) La temperatura es reducida a 50-60ºC: primers se hibridan en sus posiciones de pegado (annealing). Síntesis de ADN (expansión): a 72ºC (temperatura óptima para Taq pol) Primeros ciclos: grupo de productos largos se sintetiza a partir de cada cadena de ADN molde. Estos polinucleótidos tienen extremos 5´ idénticos pero extremos 3´ distintos.

Ciclos desnaturalización – hibridación (annealing) - expansión: productos largos actúan como molde para la síntesis de ADN dando productos cortos con extremos 5’ y 3’ determinados por los sitios de pegado de los primers. Ciclos subsecuentes: productos cortos se acumulan (exponencialmente) hasta que uno de los componentes se agota.

1. Desnaturalización 2. Annealing Rotura de puentes de H que unen desoxinucleótidos (temperatura depende de contenido de GC) 95ºC 2. Annealing Pegado de primers a secuencia target Temperatura depende de primers: muy alta  poco/nada de producto, muy baja  productos inespecíficos 3’ 5’ 5’ 3’ ADN Target forward reverse 40-60ºC

3. Extensión Producto Incorporación de los dNTPs al extremos 3´ libre TAQ dNTPs libres Incorpora 100 nt por segundo Extensión final 5 min: asegura que productos de amplificación estén completamente terminados Longitud determinada por distancia que separa sitios de pegado de primers Productos largos amplifican con < eficiencia (existen enzimas más eficientes para estos) Productos cortos pueden confundirse con dímeros de primers en un gel. Producto

PCR Verificación del producto de PCR en gel de agarosa Marcador de tamaño molecular Productos de PCR

¿Por qué el número de ciclos no puede ser mayor a 40? Efecto plateau Degradación de reactivos Inactivación de la enzima Agotamiento de reactivos

Controles de la PCR La PCR siempre debe contar con un control positivo y uno negativo. Estos controles son necesarios para: Comprobar que no exista contaminación en la mix de reacción (control negativo) Corroborar que si no existe el producto deseado, no es por un desperfecto en la reacción (control positivo). CONTROL NEGATIVO: se utiliza agua como molde CONTROL POSITIVO: se utiliza como molde ADN que se sabe tiene el sitio de pegado de primers.

Falsos positivos y negativos de la PCR Causas de falsos positivos CONTAMINACIÓN!! Amplificación inespecífica Causas de falsos negativos Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina) Extracción del ADN defectuosa Mutación en el sitio de hibridación del cebador Baja concentración o calidad del templado Concentración incorrecta de Mg2+ o primers

Variantes de la PCR RT-PCR PCR anidada (Nested PCR) Booster PCR PCR asimétrica PCR Multiplex PCR Reversa SISPA-PCR PCR competitiva PCR en tiempo real (Real Time PCR)

RT-PCR Técnica usada para amplificar una secuencia de ácido ribonucleico (ARN). ADN ARN TRANSCRIPCIÓN RETROTRANSCRIPCIÓN

Pasos de la RT-PCR RT PCR - ADN complementario es producido a partir de ARNm + dNTPs + enzima ADN polimerasa (retrotranscriptasa) + primer de ADN = oligo(dT) (5´TTTTTT3´) que se hibrida con cola poly(A) del ARNm generando ADNc. - Luego que se completa la reacción de retrotranscripción, se realiza PCR para generar segunda cadena de ADN. ARNm RT ARNm (rosa) + ADNc (azul) DEGRADACIÓN ARN Primer cadena de ADN PCR Síntesis de segunda cadena de ADN

PCR anidada (Nested PCR) Más sensible y específica. Ideal para muestras con poca cantidad de templado.

Booster PCR Dos amplificaciones sucesivas con idéntico set de primers. Más sensible. 1° PCR 2° PCR con el mismo set de cebadores

PCR asimétrica Útil para generar sondas

PCR múltiple (Multiplex) Amplifica múltiples productos incluidos en el mismo templado

Corte con enzima de restricción PCR con un par de cebadores PCR reversa Sólo se conoce una secuencia de ADN para la hibridación de los 2 cebadores. Secuencia conocida Corte con enzima de restricción Ligación PCR con un par de cebadores Fragmento cortado

Sequence Independent Single Primer Amplification (SISPA) PCR Sirve para amplificar fragmentos de ADN de secuencia desconocida. Utiliza primers adaptadores.