http://einstein.ciencias.uchile.cl Sesión 20 martes 14 de Octubre: Fundamentos de la Neurobiología I. Dr. Osvaldo Álvarez. Electrodifusión. Ecuación de Nernst –Plank. La ecuación Goldman-Hodgkin-Katz para el potencial de reposo Potencial de membrana y su dependencia de las especies de iones. Potencial de acción; curso temporal y su descripción macroscópica http://einstein.ciencias.uchile.cl CURSO BIOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL DE LA CÉLULA II. 20 de octubre 2009

Conducción de la electricidad en soluciones de electrolitos

Energía interna E = q - w = energía que entra al sistema en forma de calor menos la que sale del sistema en forma de trabajo. ( joule) Entalpía  H =  E +  PV =  E +  producto presión volumen Entropía S = qrev / T Cambio de Entropía = calor absorbido en un proceso reversible / temperatura. Sus unidades son joule kelvin-1 Energía Libre  G = H - TS

Energía libre en sistemas abiertos. j = potencial químico el componente j. Cambio de la energía libre del sistema que se produce al agregar 1 mol de componente j, manteniendo constantes T, P y la cantidad de todos los otros componentes. ( joule / mol ).

Potencial químico estándar del compuesto j, oj es el cambio de energía libre asociado con agregar 1 mol del compuesto j, estando en su estado de referencia. Es decir a una concentración estándar. Por ejemplo = 1M, 1m, X = 1. ¿Cuál es el cambio de Energía libre asociado con agregar dnj moles estando a una concentración cualquiera? ? ¿Qué relación hay entre el potencial químico y la concentración?

Examinemos la termodinámica de un cambio de concentración. Inicial m1 cajas disponibles Final m2 cajas disponibles ¿Qué hace que las moléculas se difundan ocupando todo el volumen? El estado final tiene más entropía que el inicial. Ecuación de Boltzmann para la entropía. k es la constante de Boltzmann y W es la probabilidad estadística del sistema. W es el número de maneras distintas que se puede arreglar internamente el sistema.

Inicial m1 cajas disponibles Final m2 cajas disponibles Cálculo de la entropía. Las cajas son todas del mismo volumen. Se podría poner las N moléculas en una sola caja. Inicial m1 cajas disponibles Final m2 cajas disponibles Estado inicial: vamos a poner N moléculas en m1 cajas W ¿De cuántas maneras puedo poner la primera molécula? m1 ¿De cuántas maneras puedo poner la segunda molécula? m1 ¿De cuántas maneras puedo poner las dos primeras moléculas? m12 ¿De cuántas maneras puedo poner N moléculas para el estado inicial? m1N ¿De cuántas maneras puedo poner N moléculas para el estado final? m2N

Inicial m1 cajas disponibles Final m2 cajas disponibles Cálculo de la entropía. Inicial m1 cajas disponibles Final m2 cajas disponibles Para 1 mol de soluto R = kN = 8.3143 joulemol-1K-1

El número de moles de soluto no cambia cuando se el soluto se difunde desde una condición inicial ci Vi hasta una final cf Vf. El cambio de entropía asociado al cambio de concentración es: El cambio de energía libre asociado al cambio de concentración es: Suponemos soluciones ideales: H = 0 para la difusión. Y si ci = 1 entonces: Nota. cf es la concentración dividida por la concentración estándar. Es adimensional.

Potencial químico standard del compuesto j, oj es el cambio de energía libre asociado con agregar 1 mol del compuesto j, estando en su estado de referencia. Es decir a una concentración = 1. ¿Cuál es el cambio de energía libre asociado con agregar dnj moles estando a una concentración cualquiera? concentración = cj concentración = cj dnj dnj concentración = 1 concentración = 1

Si el componente j es un ion, es decir lleva una carga eléctrica zeo, tenemos que considerar el trabajo eléctrico de traer el ion hasta la solución Se define como potencial eléctrico en un punto del espacio, , como El trabajo asociado con traer una carga eléctrica unitaria desde el infinito hasta el punto. Se mide en volt ( joule/coulomb ). El trabajo para dn moles de iones de valencia z es zFdn, donde F es el número de Faraday (96500 coulomb/mol).

y Cada punto del espacio, definido por las coordenadas xyz se caracteriza por el valor del potencial químico de un ion. J mol-1. Es un campo escalar. Para cada punto existe un gradiente del potencial químico, que tiene unidades de fuerza. J m-1 mol-1.N mol-1. Es un campo vectorial. x z

y Cada punto del espacio, definido por las coordenadas xyz se caracteriza por un valor del potencial químico de un ion. J mol-1. Es un campo escalar. j i Para cada punto existe un gradiente del potencial químico, que tiene unidades de fuerza. J m-1 mol-1.N mol-1. Es un campo vectorial. x k z Si pongo iones en el campo van a sentir una fuerza igual a -. Los iones se van a mover con una velocidad, v; igual al producto de su movilidad, u (m s-1/M mol-1) por la fuerza (mol-1/N mol-1) .

Si pongo iones en el campo van a sentir una fuerza igual a -. y Los iones se van a mover con una velocidad, v; igual al producto de su movilidad, u (m s-1/M mol-1) por  (mol-1/N mol-1) . v A a j i x k El número de iones que atraviesa una ventana de área A en un intervalo de tiempo Dt, depende de la concentración de iones, c, de su velocidad, v; y del coseno del ángulo entre un vector perpendicular a la ventana y el vector velocidad. z El flujo de iones, J, es el número de moles que atraviesa la ventana en cada unidad de área y en cada unidad de tiempo a es un vector unitario normal a la ventana

Ecuación de Nernst-Planck Electrodifusión en una membrana: membrana Ecuación de Nernst-Planck x El gradiente se reduce a duj/dx Los iones se mueven en dirección normal a la superficie de la membrana

Membrana selectiva, deja entrar K+ pero no Cl-. KCl c’ JK JCl KCl c’’ c’ > c” JCl = 0 ( Condición impuesta en el planteamiento) JK = ? implica transporte de carga eléctrica. movimiento de carga eléctrica. ¿Qué pasa con el potencial eléctrico?

JK La capacidad eléctrica de las membranas biológicas es 1 F/cm2 KCl c’ KCl c’’ - + ’ c’ > c” ’ = ” Las dos soluciones separadas por la membrana constituyen un condensador eléctrico. Al transportar carga se genera una diferencia de potencial eléctrico. La relación entre carga q y potencial  es la capacidad eléctrica C del condensador, que se mide en Farad (coulomb/volt).

JK KCl KCl c’ ’ c’’ ’’ - + c’ > c” ’ < ” A medida que pasa el tiempo fluye potasio; el potencial ’ disminuye y el potencial ’’ aumenta. Esto continúa hasta que los potenciales eléctricos no cambien más. Se llega a un estado de equilibrio, ’ = ”, en que JK = 0.

Ec. de Nernst RT/F = 25 mV a 20oC En un punto en el interior de la membrana Este paréntesis se hace 0. Integramos a lo ancho de la membrana. Ec. de Nernst RT/F = 25 mV a 20oC

- + c’ ’ c’’ ’’ Ec. de Nernst - + Ec. de Nernst ¿Cómo se mide este potencial? ¿Cómo se conectan las soluciones a los cables de los instrumentos electrónicos? Usando electrodos, por ejemplo el electrodo de plata/plata clorurada. http://en.wikipedia.org/wiki/Silver_Chloride_Electrode

Alambre de Ag clorurado Electrodo Tubo de ensayo con KCl 1M Ag Ag+ + e- Ag+ + Cl- AgCl Si llega un electrón por el alambre de plata, se combina con un Ag+ y se libera un ion Cl- del AgCl. Si se va un electrón por el alambre de plata, se libera un Ag+ que se combina con un ion Cl- para formar AgCl. http://en.wikipedia.org/wiki/Silver_Chloride_Electrode

Potenciales de unión líquida. Zona de mezcla JK JCl KCl’ KCl’’ JK = JCl no hay transporte de carga eléctrica. Esta es la condición que implica una diferencia de potencial que no cambia en el tiempo.

(Electroneutralidad) En un punto en la zona de mezcla: (Electroneutralidad) Integrando entre los bordes de la zona de mezcla

Conductividad específica molar a dilución infinita El potencial de unión líquida que se desarrolla entre dos soluciones de KCl es despreciable porque las movilidades de K+ y Cl- son muy parecidas Robinson y Stokes. Electrolyte solutions. Butterwoths. London 2ª edicion 1959.

Construcción de un electrodo Alambre de Ag clorurado Tubo de ensayo con KCl 1M Electrodo Puente de agar-KCl 1M http://en.wikipedia.org/wiki/Silver_Chloride_Electrode

Ecuación de Henderson del potencial de juntura para mezclas más complejas. Henderson.xls pCLAMP_AppNote_LJP_Corrections.pdf En http://einstein.ciencias.uchile.cl http://www.moleculardevices.com/pdfs/pCLAMP_AppNote_LJP_Corrections.pdf

- + c’ ’ c’’ ’’ V Ec. de Nernst. Deducida para corriente = 0 - + V ¿Cómo se mide este potencial sin tomar corriente? Se construye un vólmetro que no tome corriente usando amplificadores operacionales. http://en.wikipedia.org/wiki/Operational_amplifier http://en.wikipedia.org/wiki/Operational_amplifier_applications

Midiendo voltaje tomando corriente Midiendo voltaje sin tomar corriente V1 R1 http://en.wikipedia.org/wiki/Field-effect_transistor http://en.wikipedia.org/wiki/Operational_amplifier http://en.wikipedia.org/wiki/Operational_amplifier_applications

A > 105 Si A >> 1 Si A >> 1 Amplificador operacional con realimentación negativa V1 R1 A > 105 Si A >> 1 Si A >> 1

Integración de la ecuación de Nernst-Plank

Coeficiente de Difusión, D. Ecuación de Einstein: Unidades del Coeficiente de Difusión: Potencial reducido, adimensional

Integración por partes Multiplico ambos lados por ezU Recordar esto Aplicar a:

? ? Recordar esto

Para integrar el lado izquierdo necesitamos conocer U en función de x. Recordar esto

+ J U U extracelular U intracelular - x 0  Suposición de Goldman: el campo eléctrico es constante en el interior de la membrana ( dU/dx = constante). intracelular membrana extracelular + J U U extracelular U intracelular - x 0  En esta ecuación  es el espesor de la membrana. Vamos a integrar la ecuación de Nernst-Planck entre los bordes de la membrana. Condiciones de borde: Borde Intracelular x = 0, c(0) = c’int, U(0) = Um Borde Extracelular x = , c() = c’ext, U() = 0.

En estado estacionario, el flujo, J, es igual en todos los puntos de la membrana. La ecuación de Nernst-Planck en punto x en el interior de la membrana. Separo las variables . Uso la suposición de campo constante . Integro desde x = 0 hasta x =  .

Estamos integrando la ecuación de Nernst-Planck entre los bordes de la membrana. Condiciones de borde: Borde Intracelular x = 0, c(0) = c’int, U(0) = Um Borde Extracelular x = , c() = c’ext, U() = 0.

Definición de la permeabilidad de la membrana, P. Las concentraciones en los bordes interno y externo de la membrana, c’int y c’ext, se relacionan con las concentraciones en las soluciones internas y externas, c y cext mediante el coeficiente de partición . Definición de la permeabilidad de la membrana, P. Esta es la ecuación de flujo de Goldman - Hodgkin - Katz

¿Cuánto es el flujo para Um  0? Otra manera de verlo: Usar ex -1  x para x 0

Potencial eléctrico de una membrana permeable a Na, K y Cl, que separa soluciones que contienen estos tres iones. Na+ K+ Cl- JNa JK JCl Condición de potencial eléctrico constante es corriente cero INa + IK + Icl = 0. Condición de corriente cero es JNa + JK - Jcl = 0.

Multiplica el flujo de Cl- por eUm / eUm Multiplica el flujo de Cl- por -1/-1 para dejar todas las expresiones con denominador común JNa + JK - JCl = 0

JNa + JK - JCl = 0 La suma tiene que ser cero La ecuación Goldman-Hodgkin-Katz para el potencial de reposo

Iones en una célula de jibia. Na+ 50 mM K+ 440 mM Cl- ? in -60 mV Na+ 440 mM K+ 10 mM Cl- 450 mM ex 0 mV Si la membrana es permeable al ion cloruro y no hay una bomba de cloruro, esperamos que el cloruro esté en equilibrio. La concentración la podemos calcular usando la ecuación de Nernst. Cl = m El experimento confirma que la concentración intracelular de cloruro es efectivamente 41 mM.

Iones en una célula de jibia. Na+ 50 mM K+ 440 mM Cl- 41 mM in -60 mV Na+ 440 mM K+ 10 mM Cl- 450 mM ex 0 mV Na+ 50 mM K+ 440 mM Cl- 41 mM A- 449 mM A- =Aniones orgánicos no difusibles. Armstrong, C. 2003. The Na/K pump, Cl ion, and osmotic stabilization of cells. PNAS 100:6257-6262

VNernst VNa VK GHK.xls in ex P Na 50 440 1.0000 K 10 0.0000 Cl 41 450 54.7800 in ex P Na 50 440 0.0000 K 10 1.0000 Cl 41 450 V -95.3203 in ex P Na 50 440 0.0000 K 10 Cl 41 450 1.0000 V -60.3449 VNernst in ex P Na 50 440 1.0000 K 10 0.0816 Cl 41 450 0.0000 V 41.2000 in ex P Na 50 440 0.0317 K 10 1.0000 Cl 41 450 0.0000 V -73.4000 VNa VK GHK.xls

Potencial de reposo -60 mV in ex P Na 50 440 1.0000 K 10 0.0000 Cl 41 450 V 54.7800 in ex P Na 50 440 0.0000 K 10 1.0000 Cl 41 450 V -95.3203 in ex P Na 50 440 0.0000 K 10 Cl 41 450 1.0000 V -60.3449 Potencial de reposo -60 mV in ex P Na 50 440 0.0705 K 10 1.0000 Cl 41 450 0.1000 V -60.0000 in ex P Na 50 440 0.0717 K 10 1.0000 Cl 41 450 V -60.0000 in ex P Na 50 440 0.0834 K 10 1.0000 Cl 41 450 10.0000 V -60.0000 Potencial en el pico del potencial de acción 25 mV in ex P Na 50 440 4.2425 K 10 1.0000 Cl 41 450 0.1000 V 25.0000 in ex P Na 50 440 7.7029 K 10 1.0000 Cl 41 450 V 25.0000 in ex P Na 50 440 42.3068 K 10 1.0000 Cl 41 450 10.0000 V 25.0000 GHK.xls

La densidad de la corriente La densidad de corriente llevada por un ion. La densidad de corriente llevada por un ion.

IK INa Vm, mV Forma de las curvas I/V para K y Na según GHK, las concentraciones intra y extracelulares en el axón de jibia, y los potenciales de inversión para las corrientes de sodio y potasio.

Caso límite de la ecuación GHK: cin = cex, UNernst = 0 La ecuación GHK se reduce a la ley de Ohm. Para cin = cex Caso límite de la ecuación GHK: cin  cex, UNernst << 1 Admitiendo estas aproximaciones para UNernst y Um chicos:

0 Medición del potencial de reposo A=105 Esto se cumple para todos los circuitos con realimentación negativa

m Im Im Inyectando corriente Electrodo de tierra es muy grande. La densidad de corriente (A/cm2) en la superficie del electrodo es pequeña porque el área es grande. La reacción redox del electrodo se puede suponer muy cerca del equilibrio Mostrar MapShow

m Im Im Midiendo la corriente El amplificador mantiene el electrodo de tierra activamente a potencial cero. La intensidad de la corriente se puede calcular del potencial eléctrico medido a la salida del amplificador. Mostrar MapShow

Imponiendo un voltaje m m

Voltage clamp m m m

Imponiendo un voltaje y midiendo la corriente con un solo amplificador. Este electrodo tiene m sólo para corrientes muy pequeñas m m m + ImR1 m Mostrar VClampShow

Imponiendo un voltaje y midiendo la corriente con un solo amplificador y un solo electrodo. Patch clamp. Este electrodo tiene m sólo para corrientes muy pequeñas m m + ImR1 m

m Im Im = 0 t < 0.01 ms Im = -50 Acm-2 0.1 < t < 0.25 ms Im = 0 t > 0.25 ms Estas simulaciones fueron hechas con MapShow.xls

m Im Im = 0 t < 0.01 ms Im = -99 Acm-2 0.1 < t < 0.25 ms Im = 0 t > 0.25 ms Estas simulaciones fueron hechas con MapShow.xls

m Im Im = 0 t < 0.01 ms Im = 10 Acm-2 0.1 < t < 0.25 ms Im = 0 t > 0.25 ms Estas simulaciones fueron hechas con MapShow.xls

m Im Im = 0 t < 0.01 ms Im = 20 Acm-2 0.1 < t < 0.25 ms Im = 0 t > 0.25 ms Estas simulaciones fueron hechas con MapShow.xls

m Im Im = 0 t < 0.01 ms Im = 35 Acm-2 0.1 < t < 0.25 ms Im = 0 t > 0.25 ms Estas simulaciones fueron hechas con MapShow.xls

m Im Im = 0 t < 0.01 ms Im = 36 Acm-2 0.1 < t < 0.25 ms Im = 0 t > 0.25 ms

The Nerve Impulse Dr. Francisco Bezanilla. http://nerve. bsd. uchicago