Actividad: Huella Genética Enzimas de restricción Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Junio 4, 2007 Actividad: Huella Genética Enzimas de restricción Original: Dr. Noel Motta y Dra. Rosa V. Flores, UPR-Río Piedras Essy Levy, M.S. y Julie Mathern, Bio-Rad

Aplicaciones al mundo real de Huella genética o “Fingerprinting” de ADN • Escena del crimen • Relación entre humanos • Paternidad • Relación entre animales Estudios antropológicos Estudios de organismos que causan enfermedades Identificación de alimentos Restos Humanos Monitoreo de transplantes

Ácido Deoxirribonucleico (ADN) En todos los sistemas biológicos el ADN es la molécula que lleva la información hereditaria mediante unidades denominadas genes. Figura B15.6 Silberberg 4ta Ed.

Ácido Deoxirribonucleico (ADN) Un gene es la secuencia de ADN necesaria para la síntesis de un polipéptido o una molécula de ARN. Un polipéptido es una secuencia de aminoácidos unidos mediante enlace químico. Las proteínas consisten de uno o más polipéptidos.

Los Genes consisten de exones y de intrones Los Genes consisten de exones y de intrones. Los exones son secuencias de ADN que se expresan en la célula. Los intrones son secuencias de ADN que no se expresan en la célula.

Los Intrones son removidos del ARN durante el proceso de Transcripción

El Genoma es el total del ADN en una célula u organismo. Genoma − ADN en las Células El Genoma es el total del ADN en una célula u organismo.

Variación Genética Los seres humanos comparten el 99.9% de su genoma. 23 pares de cromosomas Los seres humanos comparten el 99.9% de su genoma. La variación genética, o diferencias en la secuencia del ADN, ocurre en el 0.1% restante.

Regiones de Variabilidad en ADN El análisis de las regiones altamente variables es la clave para la técnica de la huella digital del ADN o Huella Genética. Muchas de las diferencias ocurren en regiones del ADN sin función conocida.

La secuencia pueden estar repetida 14 veces, 9 veces, o 4 veces. Regiones altamente variables consisten de repeticiones en tándem en número variable (“VNTR”). La repetición es una secuencia de ADN corta, entre 10 y 100 pares de bases (pb). La secuencia pueden estar repetida 14 veces, 9 veces, o 4 veces. El número de veces que está repetida puede variar de un lugar a otro en el mismo cromosoma.

También varía entre individuo a individuo. El número de veces que está repetida la secuencia de ADN varía entre cromosoma a cromosoma. También varía entre individuo a individuo. Este tipo de secuencias se llaman también “minisatélites”.

3/10 11/11 Un hijo hereda un cromosoma de cada par de cromosomas que tiene el padre y la madre. Analizando las Regiones altamente variables del hijo, se puede determinar quiénes son sus padres. 3/11 10/11

Huella Genética Es una técnica que permite detectar diferencias en el ADN en diferentes individuos, analizando los fragmentos generados por el corte de las regiones variables del ADN con enzimas de restricción. Envuelve los siguientes pasos: Aislar el ADN genómico o de las regiones variables. Cortar el ADN en pedazos más pequeños. Separar los pedazos de ADN por tamaño. Identificar las regiones variables del ADN. Analizar el perfil de pedazos de cada individuo.

Huella Genética Procedimiento Primera Parte

Huella Genética Procedimiento Segunda Parte

Huella Genética Procedimiento Tercera Parte

Enzimas de Restricción - Enzimas que cortan ADN virus • Evolucionadas por bacterias para protegerse contra infecciones virales. • Son endonucleasas, cortan en el interior de las hebras del ADN. • Se conocen más de 3,000 enzimas de restricción. bacteria

Sitio de Reconocimiento de la Enzima de Restricción Sitio de restricción Secuencia Palindrómica • Cada enzima digiere (corta) ADN en una secuencia específica, o sitio de restricción. • Las enzimas reconocen de 4 a 6 pares de bases organizadas en secuencias palindrómicas (Ej. GAATTC). Fragmento 1 Fragmento 2

Extremos Sobresalientes 5’ o 3’ La enzima corta aquí • Algunas enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 5’ (cinco primo), como la mostrada aquí. • Otras enzimas de restricción generan extremos sobresalientes 3’ (tres primo).

Enzimas de Restricción Comunes EcoRI – Eschericha coli – Extremos Sobresalientes 5’ • EcoRI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 5’. PstI – Enzima de restricción que genera extremos sobresalientes 3’. Pstl – Providencia stuartii – Extremos Sobresalientes 3’

Extremos Parejos AluI – Arthrobacter luteus – Extremos Parejos • Existen otras enzimas de restricción que generan extremos parejos; es decir, extremos que no tienen porciones sobresalientes. Ejemplos: AluI y HaeIII HaeIII – Haemophilus aegyptius – Extremos Parejos

Análisis de productos de una reacción enzimática ¿Cuántos fragmentos de ADN se obtendrían tras el corte? Escribe la secuencia de bases de los fragmentos. ¿Qué diferencias hay entre los dos fragmentos?

Otros Componentes en la Reacción de la Digestión del ADN Búfer Restricción permite las condiciones óptimas para la reacción • NaCI proporciona la concentración correcta de iónes • Tris-HCI proporciona el pH correcto • Mg2+ es un co-factor enzimático

Temperatura de la Digestión del ADN ¿Por qué incubamos a 37°C? • La temperatura del cuerpo es la temperatura óptima para éstas y otras enzimas. ¿Qué pasa si la temperatura de la reacción es demasiado fría o demasiado caliente? • Muy caliente: la enzima puede ser desnaturalizada. • Muy fría: la actividad de la enzima puede ser más lenta, requiriendo más tiempo para digerir el ADN.

Preguntas de la separata… Después de 24 horas, ¿hay alguna pista visible de que las enzimas de restricción hayan modificado de alguna forma el ADN en los tubos? Razona tu respuesta. ¿Qué es lo que determina el punto dónde una endonucleasa de restricción corta una molécula de ADN?

¿Cómo podemos detectar la posición de los sitios de restricción para EcoRI y PstI en nuestras muestras de ADN? Una manera para determinar la localización de los sitios de restricción podría ser averiguar lo siguiente: ¿Cuántos fragmentos de ADN de diferente tamaño hay en cada muestra? ¿Cuáles son los tamaños relativos de cada fragmento? ¿Se encuentran los sitios de restricción para EcoRI y PstI localizados en los mismos puntos en cada muestra de ADN?

Paso 1: Aislar el ADN Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano: sangre semen tejido de una víctima muerta células del folículo capilar saliva

Paso 2: Cortar el ADN El ADN se corta con enzimas de restricción, proteínas que reconocen secuencias específicas de ADN de cadena doble y catalizan el rompimiento del enlace que une dos nucleótidos dentro de esa secuencia. Secuencia reconocida es palindrómica – lee igual en dirección 5’ a 3’ .

Paso 3: Separar pedazos de ADN

Paso 4: Hallar Regiones Variables

Paso 5: Analizar perfil de pedazos

Electroforesis en Agarosa: aplicando las muestras • Corriente Eléctrica La corriente mueve el ADN, que tiene una carga negativa, hacia el electrodo positivo (+, rojo). Búfer Tinta Gel de agarosa Fuente de Poder

Electroforesis en Agarosa: corriendo las muestras • La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes. Corriendo la Gel Fuente de Electricidad

Asegúrese de que los pozos están en el lado del polo (-).

Preguntas para análisis El aparato de electroforesis origina un campo eléctrico con un polo positivo y otro negativo situados en cada extremo del gel. ¿A qué polo (+ o -) crees que migrarán las muestras de ADN? Explica por qué. ¿Qué color representa al polo negativo? Después de cargar las muestras de ADN en los pocillos, se les fuerza a moverse a través de la matriz del gel. ¿Qué fragmentos (grandes o pequeños) crees que migrarán al extremo opuesto del gel con mayor rapidez? Explica por qué. ¿Qué fragmentos (grandes o pequeños) esperas que se desplacen la mínima distancia desde el pocillo? Explica por qué.

Electroforesis en Agarosa: resultados típicos • La gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido y progresan más lejos que los fragmentos más grandes.

Actividad 1: Huella Genética de un Individuo ¿Cuáles son los cromosomas que posee cada individuo? Individuo #1: Dos cromosomas A; homocigótico (A/A). Individuo #2: Un cromosoma A y otro B; heterocigótico (A/B). Individuo #3: Dos cromosomas B; homocigótico (B/B).

Actividad 2: Enzimas de Restricción # Fragmentos 3 3 2 3

Huella Genética de María y José Actividad 2: Enzimas de Restricción Huella Genética de María y José Fragmentos de María: uno de 38 pb uno de 28 pb uno de 10 pb dos de 7 pb Fragmentos de José: uno de 25 pb uno de 20 pb uno de 15 pb uno de 13 pb uno de 10 pb uno de 7 pb

Actividad 3: Se mezclan bebés

Actividad 4: Caso de Paternidad ¿Qué bebé podría ser hijo del Sr. Megabucks? El #2.

Actividad 5: Caso del Cuchillo ¿Mató Sminks a Millhouse? No hay pruebas suficientes.

Cierre de la Actividad Huella Genética ¿Como explicas el que cada individuo tenga una huella genética única? Debido a las variaciones en el ADN en ciertas regiones de los cromosomas. ¿Qué otros usos se le puede dar a la técnica de huella genética? Estudios de evolución y de taxonomía Identificación de desaparecidos