Axón de jibia 9 de abril de Fisiología General 2009, Clases, AxondeJibia.ppt

I, mA/cm 2 t, ms Voltage clamp de un axón de jibia -60,8mV 0mV

I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na Control TTX I, mA/cm 2

Pulso -120 a 100 mV Vm El curso temporal del desarrollo de la corriente de potasio no sigue un curso exponencial. Para estudiar la relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana se mide a diferentes potenciales.

Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? Vm, mV I K, mA cm -2 Relación entre la intensidad de la corriente de potasio y el potencial de la membrana.

Estrategia para buscar el potencial de inversión V K. Sospecha: V K = -94 mV Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué? Porque los canales están cerrados a -94 mV. Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V. V m, mV IK, mA/cm 2

Prepulso constante Pulso de prueba variable Vm 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.

V K = -73,4 mV Los canales de K cumplen la ley de Ohm.

Sorpresa: El valor encontrado, -74 mV es menos negativo que el esperado según Nernst (-94mV). Una explicación posible: los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na. Tarea: Calcular G K /G Na para estos canales V K = -73,4 mV El potencial de reposo es -60 mV, los potenciales de inversión de las corrientes de potasio y leak son -73 y -50 mV respectivamente. Calcule la razón G K /G Leak para el potencial de reposo.

V m, mV IK, mA/cm 2 V K =-73.4 mV

V m, mV I K, mA/cm 2

Vm, mV G K /G K,max Conductancia estandarizada en estado estacionario

Los canales de K son tetrámeros. Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina. Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo Los sensores de potencial operan en forma independiente. El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos. Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo La probabilidad de encontrar un canal abierto es...n4n4

Vm, mV G K /G K,max

Vm, mV

V 0 = -46 mV z = 1.4 Vm, mV

V 0 = -47 mV z = 1.8 Errores pesados por 1/n Vm, mV

V 0 = -48 mV z = 1.2 Errores pesados por n La curva n vs V m no se ajusta bien a una función de Boltzmann. Vm, mV

Cinética Caso n(0)=0, el curso temporal de la corriente es sigmoideo Caso n(∞)=0, el curso temporal de la corriente es exponencial

Vm -140mV 0 mV -100mV

 = 1.8 ms

 = 4.7 ms

  ms -1  n Ecuaciones empíricas de Hodkin y Huxley Ver “El impulso nervioso” por F. Bezanilla en libro Biofísica y Fisiología Celular. Eds. R.Latorre et al.

Ng k = 35.3 mS/cm 2 V K = -73,4 mV Descripción completa de los canales de K del axón de jibia nn nn

Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV. Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV. Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV. Calcular la probabilidad de encontrar canales con 0, 1, 2, 3, y 4 sensores activos, si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV. Para una membrana con un solo canal, calcule el tiempo que tarda en abrirse el canal por primera vez al cambiar el potencial desde -60 mV a 0 mV. Para una membrana con un solo canal, calcule el tiempo que tarda en abrirse el canal por primera vez al cambiar el potencial desde -160 mV a 0 mV.

Canales de sodio del axón de jibia

I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

-60 mV 0 mV Vm La corriente de Na presenta inactivación Con el uso de TTX se puede aislar la fracción de la corriente llevada por los canales de sodio.

-60 mV 0 mV Vm La corriente de Na presenta inactivación 30 mV Procedimiento para demostrar que los canales de sodio cumplen la ley de Ohm y encontrar el potencial de inversión de la corriente

V Na = 41.2 mV Los canales de sodio cumplen la ley de Ohm

Figure Ball-and-Chain Model for Channel Inactivation. The inactivation domain, or "ball" (red), is tethered to the channel by a flexible "chain" (green). In the closed state, the ball is located in the cytosol. Depolarization opens the channel and creates a negatively charged binding site for the positively charged ball near the mouth of the pore. Movement of the ball into this site inactivates the channel by occluding it. [After C. M. Armstrong and F. Bezanilla. J. Gen. Physiol. 70(1977):567.] El modelo de bola y cadena para la inactivación de los canales de sodio

Topología de un canal de sodio membrana

-60 mV 0 mV Tratando los axones con pronasa se puede estudiar la activación sin interferencia de la inactivación

-60 mV 0 mV -40 mV Procedimiento para determinar la conductancia de los canales tratados con pronasa.

I Na,max = mAcm -2 a -40 mV G Na,max = 116 mS cm -2 V Na = 41.2 mV Corriente inicial de cola en los axones tratados con pronasa

-40 mV 0 mV Vm -60 mV Cinética de la activación

x = 1 Suma de cuadrados = 8.0 La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial elevada a la cuarta potencia.

x = 2 Suma de cuadrados = 0.14 La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. En el caso de los canales de potasio lo simulamos usando una función exponencial elevada a la cuarta potencia.

x = 3 Suma de cuadrados = 0.00 La activación de los canales de sodio tiene un curso temporal sigmoidal. Lo simulamos usando una función exponencial elevada a la tercera potencia.

Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.

 m (0 mV) = 0.27 ms

Con buenas estimaciones de m inicial y final para cada transición se puede encontrar tau m usando Solver.  m (0 mV) = 0.27 ms  m (-40mV) = 0.48 ms

Tau m en función del voltaje

Como ya sabemos la relación entre p Na y m podemos calular de m(∞)

m(  )

Como ya sabemos m y tau podemos calular alfa y beta

 m y  m a diferentes voltajes Demostrar que  m = 1 para el límite V m  -35 mV

La inactivación. La variable h representa probabilidad de que los canales NO estén inactivados. Para h = 1 los canales no están inactivados.(la pronasa hace h =1) Para h = 0 los canales están inactivados La probabilidad de encontrar un canal conduciendo es m 3 h

-60 mV 0 mV Procedimiento para determinar h infinito en función del voltaje- Prepulso variable Pulso variablede pruena fijo Medir la corriente en el mínimo.

h(  )

-100 mV -60 mV -40 mV -60 mV Determinación de tau h mediante ajuste de curvas al curso temporal de la corriente de sodio

-100 mV -60 mV -40 mV -60 mV

 h = 3.4 ms

-60 mV 0 mV Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso temporal del escape de la inactivación

Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación

 h = 8.2 ms Procedimiento para determinar tau h midiendo el curso tempooral del escape de la inactivación

Tau h en función del voltaje

Como ya sabemos m y tau en función de Vm, podemos calcular alfa y beta

N Na g Na = 120 mS/cm 2 hh mm  h, ms  m, ms V Na = 41,1 mV Vm, mV

Calcular la fracción de canales de sodio abiertos después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV. Calcular la fracción de canales de sodio inactivados si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 m. Calcular la fracción de canales de sodio inactivados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV. Calcular la fracción de canales de sodio cerrados después de 0.6 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.

Potencial de reposo y potencial de acción de membrana

VmVm IKIK I Na ILIL ICIC ImIm En el potencial de reposo I m = 0 e I C = 0 Potencial de reposo

VmVm IKIK I Na ILIL ICIC ImIm El problema tiene solución porque yo conozco n , m  y h  en función del potencial de la membrana. La tarea ahora es buscar un V r se satisfaga esta ecuación.

N K g K =36 mS/cm 2 V K =-73,3 mV N Na g Na =120 mS/cm 2 V Na = 41,1 mV N L g L =0,3 mS/cm 2 V L = -50,1 mV

Ecuaciones de Hodgkin y Huxley 1952 J. Physiol.117: En : F. Bezanilla “El Impulso Nervioso” En: Biofísica y Fisiología Celular, Latorre et al ed. Universidad de Sevilla, Sevilla Ecuaciones empíricas basadas en Hodgking y Huxley Las constantes  y  están en ms -1 y V en mV.

Vm,(mV) hh mm nn Celda Objetivo Celda a ajustar para que la celda objetivo sea cero Solver : Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero.

Solver : Buscar que potencial hace que la intensidad de la corriente sea cero. Este es el Potencial de Reposo.

Axón de jibia V Na 41.1 mV G Na 6  Scm -2 V K mV G K 320  Scm -2 V L mV G L 330  Scm -2 VmVm C M 1  Fcm -2 Tarea: Calcular el potencial de reposo dadas estas conductancias y potenciales de inversión de las corrientes.

Potencial de acción de membrana.

-60,8 mV En el potencial de reposo se cumple que  I i = 0 Vm, mV Im, (  Acm -2 )

0,5 mV Al cambiar el potencial de la membrana inyectando corriente,  Ii ya no es 0, es la corriente que necesito para ir a -80 mV. ¿Cuál será la trayectoria del potencial desconecto la corriente, es decir hago I m = 0. Vm, mV Im, (  Acm -2 )

0,5 mV La trayectoria apunta a -60 mV Vm, mV Im, (  Acm -2 ) ¿Cuál será la trayectoria del potencial desconecto la corriente, es decir hago I m = 0.

0,5 mV ¿Trayectoria esperada? Vm, mV Im, (  Acm -2 )

1,0 mV Vm, mV Im, (  Acm -2 ) ¿Trayectoria esperada?

0,5 mV ¿Trayectoria esperada? Vm, mV Im, (  Acm -2 )

Computación de la trayectoria V m, n, m y h son los valores iniciales de la trayectoria. Con estas corrientes se calcula la derivada dV m /dt Ahora calculo el nuevo V m Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm a Vm(  t) por  t unidades de tiempo.

Computación de lo nuevos valores de n,m y h. n, m y h infinitoTau de n, m y h (ms) n (t+  t) es el nuevo valor de n n  es el valor esperado para el nuevo V m.(se lee del gráfico A) n (t) es el valor anterior de n.  n es el valor de la constante de tiempo para el nuevo V m. (se lee del gráfico B) Vm A B hh mm nn hh nn mm

Computación de lo nuevos valores de n,m y h. n, m y h infinitoTau de n, m y h (ms) m (t+  t) es el nuevo valor de m m  es el valor esperado para el nuevo V m.(se lee del gráfico A) m (t) es el valor anterior de m.  m es el valor de la constante de tiempo para el nuevo V m. (se lee del gráfico B) Vm A B hh mm nn hh nn mm

Computación de lo nuevos valores de n,m y h. n, m y h infinitoTau de n, m y h (ms) h (t+  t) es el nuevo valor de h h  es el valor esperado para el nuevo V m.(se lee del gráfico A) h (t) es el valor anterior de h.  h es el valor de la constante de tiempo para el nuevo V m. (se lee del gráfico B) Vm A B hh mm nn hh nn mm

Computación de la trayectoria V m, n, m y h son los valores actualizados. Con estas corrientes se calcula la derivada dV m /dt Ahora calculo el nuevo V m Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm(  t) a Vm(2  t) por  t unidades de tiempo.

Computación de la trayectoria V m, n, m y h son los valores actualizados. Con estas corrientes se calcula la derivada dV m /dt Ahora calculo el nuevo V m Ahora calculo los nuevos valores de n, m y h para en cambio de voltaje desde Vm(2  t) a Vm(3  t) por  t unidades de tiempo. Así se continúa por toda la trayectoria...

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Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) I m, (mAcm -2 ) VKVK V Na

Tiempo, milisegundos Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) I Na, (mAcm -2 ) VKVK V Na I Na

Potencial de acción de membrana. Tiempo, (ms) Vm, (mV) I K, (mAcm -2 ) VKVK V Na I Na IKIK