BOLILLA 2- 1° parte Transporte electrónico y fosforilación oxidativa. Mitocondrias. Cadena respiratoria. Localización. Balance energético. Desacoplantes: proteínas desacopladoras. Inhibidores. Síntesis de ATP. Hipótesis quimiosmótica. Translocasas. Regulación de la fosforilación oxidativa. Oxidasa alternativa en vegetales. Luciferina-luciferasa. Fotofosforilación y fotosíntesis: Proceso en plantas superiores. Reacciones luminosas. Captación de la energía luminosa. Cloroplastos y pigmentos. Transporte electrónico cíclico y no cíclico. Síntesis de ATP por fotofosforilación. Similitudes entre fosforilación oxidativa y fotofosforilación. Concepto unificador de la teoría quimiosmótica. Otros organismos fotosintetizadores. Sistema microsomal de transporte electrónico. Formación de compuestos oxígeno-reactivo. Radicales libres. Sistemas de protección.

Compuestos con uniones ricas en energía Hidratos de carbono GLUCOSA OXIDACION Lípidos ACIDOS GRASOS NADH FADH2 ATP O2 Proteínas AMINOACIDOS

OXIDACION COMPLETA DE LA GLUCOSA C6H12O6 +6O2 6CO2 + 6H2O ΔG0= -2870 Kj/mol ó -686 kcal/mol

OXIDACION DE LA GLUCOSA VIA GLICOLITICA O C O – PO3 C H2 C-O-PO3 H2 1,3-Bisfosfoglicerato DG o’= - 49,3 kJ/mol װ ו CH2 C – O – PO3 COO- Fosfoenolpiruvato (PEP) DGo’ = - 61,9 kJ/mol װ ו

Ciclo de los ácidos tricarboxílicos, Ciclo del ácido cítrico CH3 O C – S-CoA Acetil-CoA DGo’ = - 32,2 kJ/mol ו װ 1 2 2 O2 CR Ciclo de Krebs, Ciclo de los ácidos tricarboxílicos, Ciclo del ácido cítrico O2 CR CR O2 CR O2 Hans Krebs,1937.

OXIDORREDUCTASAS (DESHIDROGENASAS) Deshidrogenasas nicotinamídicas, o ligadas a NAD. Deshidrogenasas flavínicas, o ligadas a FAD o a FMN. AH2 + NAD+ A + NADH + H+ AH2 + FAD+ (FMN+) A + FADH2 (FMNH2)

REACCION DE REDUCCION DE NAD+ .. H H + H+ │ R R │ │H + :H- (ion hidruro) Anillo de nicotinamida NAD OXIDADO (NAD+) NAD REDUCIDO (NADH + H+)

REACCION DE REDUCCION DEL ANILLO FLAVINICO . H + - Anillo isoaloxacina R e- + H+ e- + H+ R H FADH2 o FMNH2

Compuestos con uniones ricas en energía Hidratos de carbono GLUCOSA OXIDACION Lípidos ACIDOS GRASOS NADH FADH2 ATP O2 Proteínas AMINOACIDOS

Adenosina Trifosfato (ATP)

Energía de Hidrólisis de los Compuestos de elevada Energía Hidrólisis con eliminación de la repulsión de cargas Ionización Estabilización por resonancia

ATP O O O -O-P-O-P-O -P-O-Ribosa-Adenina װ O- O- O- Mg MgATP2- ו Activación de Acidos grasos Polimerización de ARN o ADN Activación de Aminoácidos Quimioluminiscencia DGo’= - 32,2 kJ/mol AMP + PPi 2 Pi DGo’= - 33,4 kJ/mol

MECANISMOS DE SINTESIS DE ATP FOSFORILACION A NIVEL DE SUSTRATO FOSFORILACION OXIDATIVA HIDRÓLISIS DE UNA UNION DE ALTA ENERGIA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRONICO O2

OXIDACION DE LA GLUCOSA VIA GLICOLITICA O C O – PO3 C H2 C-O-PO3 H2 1,3-Bisfosfoglicerato DG o’= - 49,3 kJ/mol װ ו CH2 C – O – PO3 COO- Fosfoenolpiruvato (PEP) DGo’ = - 61,9 kJ/mol װ ו

Ciclo de los ácidos tricarboxílicos, Ciclo del ácido cítrico CH3 O C – S-CoA Acetil-CoA DGo’ = - 32,2 kJ/mol ו װ 1 2 2 O2 CR Ciclo de Krebs, Ciclo de los ácidos tricarboxílicos, Ciclo del ácido cítrico O2 CR CR O2 CR O2 Hans Krebs,1937.

MECANISMOS DE SINTESIS DE ATP FOSFORILACION A NIVEL DE SUSTRATO FOSFORILACION OXIDATIVA HIDRÓLISIS DE UNA UNION DE ALTA ENERGIA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRONICO O2

Destino de los equivalentes de reducción CK Memb.interna Espacio Intermem-brana Memb. interna Memb.externa Crestas Mitocon- driales Matriz

CADENA DE TRANSPORTE ELECTRONICO Los componentes de la cadena se encuentran en la membrana mitocondrial interna. Reciben equivalentes de reducción de NADH y FADH2 producidos en la matriz mitocondrial. El aceptor final de electrones es el oxígeno. Los componentes se encuentran ordenados en orden creciente de sus potenciales de reducción.

COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRONICO FLAVOPROTEINAS (FMN ó FAD): Transportan 2 e- y 2 H+ PROTEINAS FERROSULFURADAS: transportan e- (Fe+++ Fe++) COENZIMA Q ó UBIQUINONA: Quinona isoprenoide no proteica. Transporta 1 e- y libera 2 H+ a la matriz. CITOCROMOS b, c, c1, a, a3: Proteínas que contienen un grupo hemo. Transportan solo 1 e-.

Ubiquinona + 2 H+ + 2 e- → ubiquinol + 0.045 POTENCIALES DE REDUCCIÓN ESTÁNDAR DE LOS TRANSPORTADORES DE LA CADENA RESPIRATORIA Reacción redox (media reacción) E´0 (V) 2 H+ + 2 e- → H2 - 0.414 NAD+ + H+ + 2 e- → NADH - 0.320 FMN + 2 H+ + 2 e- → FMNH2 - 0.300 FAD + 2 H+ + 2 e- → FADH2 - 0.220 Ubiquinona + 2 H+ + 2 e- → ubiquinol + 0.045 Citocromo b (Fe3+) + e- → citocromo b (Fe2+) + 0.075 Citocromo c1 (Fe3+) + e- → citocromo c1 (Fe2+) + 0.220 Citocromo c (Fe3+) + e- → citocromo c (Fe2+) + 0.254 Citocromo a (Fe3+) + e- → citocromo a (Fe2+) + 0.290 Citocromo a3(Fe3+) + e- → citocromo a3(Fe2+) + 0.550 ½ O2 + 2 H+ + 2 e- → H2O + 0.820

Complejos de la Cadena de transporte electrónico-Citocromo c Complejo enzimático Grupos prostéticos Complejo I (NADH deshidrogenasa) FMN, FeS Complejo II(succinato deshidrogenasa) FAD,FeS Complejo III (citocromos b y c1) Hemo, FeS Citocromo c Hemo Complejo IV (citocromo a-a3) Hemo, Cu

O2 H2O Fumarato FAD Succinato NADH II e- Fe-S NAD+ FMN I III Cit.c Complejo II SUCCINATO DESHIDROGENASA FAD Fe-S II NADH FMN Fe-S I NAD+ Succinato e- Fe-S Fe III Coenzima Q Fe Cit.c Complejo I NAD UBIQUINONA REDUCTASA Cit.b /Centro Fe-S/ Cit c1 Fe/Cu O2 IV Complejo III CITOCROMO C –COENZIMA Q OXIDO REDUCTASA Cit.a Cit a3 Complejo IV CITOCROMO OXIDASA H2O

Reacciones que proveen de NADH a la cadena respiratoria 1 2 NADH + H+ piruvato deshidrogenasa 2 O2 CR malato deshidrogenasa Ciclo de Krebs O2 CR CR O2 Isocitrato deshidrogenasa α-cetoglutarato deshidrogenasa CR O2 Hans Krebs,1937.

REACCIONES DEL COMPLEJO I NADH + H+ NAD+ + 2 e- + H+ (Eo= - 0,32 V) FMN + 2 e- + 2 H+ FMNH2 (Eo= - 0,22 V) NADH + H+ + FMN → FMNH2 + NAD+

Camino de los equivalentes de reducción en el Complejo I

Reacciones que proveen de FADH2 a la cadena respiratoria 1 2 NADH + H+ 2 O2 CR Ciclo de Krebs O2 CR CR O2 Succinato deshidrogenasa CR O2 Hans Krebs,1937.

O2 H2O Fumarato FAD Succinato NADH e- II Fe-S NAD+ FMN I III Cit.c Complejo II SUCCINATO DESHIDROGENASA FAD Fe-S II NADH FMN Fe-S I NAD+ Succinato e- Fe-S Fe III Coenzima Q Fe Cit.c Complejo I NAD UBIQUINONA REDUCTASA Cit.b /Centro Fe-S/ Cit c1 Fe/Cu O2 IV Complejo III CITOCROMO C –COENZIMA Q OXIDO REDUCTASA Cit.a Cit a3 Complejo IV CITOCROMO OXIDASA H2O

COMPLEJO II Succinato-coenzima Q oxidorreductasa Coenzima: FAD Proteínas ferrosulfuradas Transfiere equivalentes de reducción desde succinato a la coenzima Q Succinato + FAD Fumarato + FADH2 FADH2 + Prot-Fe3+ FAD + Prot-Fe2+ Prot-Fe2+ + CoQ Prot-Fe3+ + CoQH2

REACCION DE LA UBIQUINONA Radical semiquinona R H R Ubiquinona (UQ) e- + H+ e- + H+ R H Ubiquinol (UQH2)

Otras deshidrogenasas que entregan electrones a la Ubiquinona Acil-CoA deshidrogenasa Glicerol-3-fosfato deshidrogenasa FADH2 CoQ FADH2 CoQ

CAMINO DE LOS ELECTRONES desde el COMPLEJO III al O2 ½ O2 + H+ CoQH2 Fe+++ Fe++ Fe+++ Fe++ Fe+++ Fe++ Cit. b566 Cit. b562 Cit. c1 Cit. c Cit. a.a3 Fe-S CoQ H2O Fe++ Fe+++ Fe++ Fe+++ Fe++ Fe+++ Complejo III Complejo IV

Estructura de los citocromos Hemo A (Citocromo a y a3) Estructura general de citocromo c y c1

SINTESIS DE ATP TEORIA QUIMIOSMOTICA H+ MATRIZ ESPACIO INTERMEMBRANA H+ H+ e- e- e- e- H+ H+ H+ H+ H+ H+ 3 ATP

H+ H+ H+ e- e- e- 2 ATP H+ H+ H+

TRANSLOCACION DE PROTONES Y SINTESIS DE ATP Pi Pi 31

POSTULADOS DE LA TEORIA QUIMIOSMOTICA Membrana mitocondrial impermeable a protones. Expulsión de H+ durante el transporte de electrones. Formación de un gradiente electroquímico (H+ y cargas positivas). El pasaje de los H+ a través de Fo activan la ATP sintasa.

INHIBIDORES Inhibidores del transporte electrónico Inhiben solamente el transporte de e- Inhibidores de la fosforilación Inhiben la síntesis de ATP e indirectamente, el transporte de e-. Desacoplantes Impiden la síntesis de ATP, y aceleran el transporte de electrones. Inhibidores de la translocasa Inhiben la entrada de ADP y la salida de ATP desde la mitocondria.

ACCION DE INHIBIDORES CN- CO Inhiben la citocromo oxidasa Antimicina A (antibiótico) bloquean citb/citc1 Rotenona (insecticida) Amital (barbitúrico) Inhiben Fe-S/CoQ NADH FMN Fe-S CoQ cit b Fe-S cit c1 citc cit a cit a3 O2 (-0.32) (+0.82) Tetrametil p-fenilendiamina Aceptores artificales de electrones Azul de metileno 2,6 diclorofenol indofenol Ferricanuro

INHIBIDORES DE LA FOSFORILACIÓN Oligomicina: Bloquea el flujo de protones a través de Fo. Se inhibe la síntesis de ATP Se acumulan protones y se produce una fuerza inversa deteniéndose el transporte de electrones.

DESACOPLANTES Actúan como ionóforos eliminando el gradiente de protones. Desacoplan la fosforilación del transporte electrónico O- 2,4 Dinitrofenol (DNP) + H+ Forma protonada que atraviesa la membrana

Relacion P/O en presencia de Inhibidores c/Inh. del COMPLEJO I c/Inh. del COMPLEJO I c/Inh. del COMPLEJO I c/Inh. del COMPLEJO I P/O = 0 e- e- e- (Q al O2) Sustrato: NADH e- e- e- P/O = 3/1 Sin Inhibidor Sin Inhibidor c/Inh. del COMPLEJO II c/Inh. del COMPLEJO II c/Inh. del COMPLEJO II c/Inh. del COMPLEJO II e- e- e- P/O = 3/1 C/ DESACOPLANTES C/ DESACOPLANTES C/ DESACOPLANTES P/O = 0/1 e- e- e- e- e- e- e- e- e- (Q al O2)

Sustrato: FADH2 P/O = 2 P/O = 0 P/O = 2 P/O = 0 c/Inh. del COMPLEJO I e- e- e- (Q al O2) e- e- e- Sin Inhibidor Sin Inhibidor P/O = 0 c/Inh. del COMPLEJO II c/Inh. del COMPLEJO II c/Inh. del COMPLEJO II c/Inh. del COMPLEJO II e- e- e- (Q al O2) P/O = 2 C/ DESACOPLANTES C/ DESACOPLANTES C/ DESACOPLANTES P/O = 0 e- e- e- e- e- e- e- e- e- (Q al O2)

Oxidaciones alternativas de transporte de electrones en plantas NADH Ubiquinona oxidasa O2 NADH deshidrogenasa alternativa UQ Calor NAD(P)H Deshidrogenasa externa

Funciones fisiologicas Producción de calor en algunas especies vegetales como por ej. Araceae species en un etapa anterior a la polinización para producción de compuestos aromáticos que atraen a los polinizadores. Es activa durante períodos de altas velocidades de oxidación de sustratos para evitar la producción de radicales libres.(Esqueletos carbonados C.Krebs) Es activa en situaciones de estrés (sequia, temperaturas extremas, tóxicos presentes en el suelo, falta de Pi, patógenos)( en estas situaciones disminuye la velocidad de la cadena respiratoria normal).

Control de la respiración Niveles de ADP Disponibilidad de sustrato en plantas Disponibilidad de oxígeno

ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO H2O2 OH.- Oxígeno Molecular Radical Superóxido Peróxido de Hidrógeno Radical Hidroxilo

ENZIMAS ANTIOXIDANTES Eliminacion de EROS ENZIMAS ANTIOXIDANTES SUSTANCIAS QUIMICAS ANTIOXIDANTES GPx SOD Catalasa Ascorbato Vitamina E Beta-caroteno

Enzimas antioxidantes SUPEROXIDO DISMUTASA 2 O2.- + 2 H+ H2O2 + O2 CATALASA 2 H2O2 2H2O + O2 GLUTATION PEROXIDASA 2 GSH + H2O2 GSSG + 2H2O

Localización: Microsomas y peroxisomas OXIDASAS Y OXIGENASAS Localización: Microsomas y peroxisomas No asociados a la producción de ATP Usan O2 como sustrato No incorporan O2 Oxid. OXIDASAS OXIGENASAS Incorporan un átomo del O2 MONOXIGENASAS DIOXIGENASAS Incorporan los 2 átomos del O2

Oxidación peroxisómica de ácidos grasos OXIDASAS Oxidación peroxisómica de ácidos grasos Citocromo oxidasa Flavoproteína: FADH2 FAD y O2 H2O2 Hemoproteína: Fe++ Fe+++ y O2 H2O

MONOOXIGENASAS u OXIGENASAS DE FUNCION MIXTA ó HIDROXILASAS AH + BH2 + O=O A-OH + B + H2O Sustrato principal NADH, NADPH, FMNH2, FADH2, BH4 Co-Sustrato 1 O se incorpora al sustrato y el otro O forma agua CITOCROMO P-450 Hidroxilación de esteroides Hidroxilación de fármacos Hidroxilación de xenobióticos CITOCROMO b5 Desaturación de ácidos grasos

ESQUEMA DE REACCION Y UBICACIÓN CELULAR DEL CITOCROMO 450 RH O2 NADPH NADP+ R-OH H-OH CY P450 CITOPLASMA MEMBRANA RETICULO ENDOPLASMICO

Esquema de reacción donde interviene un Citocromo P450 H2O Sustrato Sustrato hidroxilado CytP450 (red) CytP450 (oxid) RH NADPH Reducido Oxidado Citocromo P-450 Reductasa (Fe-S) Citocromo P-450 reducido O2 NADP+ H2O Reducido ROH Oxidado