Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. vectores de expresión, poseen toda la información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.

VECTORES DE CLONADO Características: PLASMIDOS : moléculas de DNA que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma Características: Son pequeños (miles de pares de bases) son circulares tienen un único origen de replicación sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción gran numero de copias marcadores que permitan su reconocimiento

Características generales de un vectores de clonado: Sitios de restricción únicos mcs Marcadores genéticos (permiten selección de transformantes) pBR322 4361 bp Orígen de replicación Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)

Características generales de un Vector de Expresión: sitios de corte de enzimas de restricción un promotor

Características generales de un Vector de Expresión: sitios de corte de enzimas de restricción un promotor

Características generales de un Vector de Expresión: sitios de corte de enzimas de restricción un promotor Sec Enhancer Tata Box Sec. Kosak atg MCS

Características generales de un Vector de Expresión: sitios de corte de enzimas de restricción un promotor un sitio de unión a ribosoma un terminador y sitio de poliadenilación marcadores de selección origen de replicación tamaño pequeño

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Que este en fase con la proteína de fusión Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Ej: Vectores serie 1 aatacG AATTCtacc ttaagCTTAA Gatgg aatacG ttaagCTTAA Vector Gtacag AATTCatgtcc cgatG AATTCatgtcc gcatCTTAA Gtacag Inserto aatacG ttaagCTTAA Gtacag AATTCatgtcc

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Que este en fase con la proteína de fusión Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Ej: Vectores serie 2 aatactG AATTCtacc ttaagaCTTAA Gatgg aatactG ttaagaCTTAA Vector Gtacag AATTCatgtcc cgatG AATTCatgtcc gcatCTTAA Gtacag Inserto aatactG ttaagaCTTAA Gtacag AATTCatgtcc

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Que este en fase con la proteína de fusión La resistencia del plasmido

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Que este en fase con la proteína de fusión La resistencia del plasmido El nivel de expresión de la proteína

El nivel de expresión depende del promotor Promotores El nivel de expresión depende del promotor Constitutivos: siempre están transcribiéndose.Ej SV40, RSV,CMV Inducibles: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T).Ej: Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona

se ligan los fragmentos generándose un vector recombinante Proceso de clonado:   se corta el ADN de interés y el vector con la misma enzima de restricción se ligan los fragmentos generándose un vector recombinante se transforman células del organismo huésped - se seleccionan las que portan el plásmido - Obtención de grandes cantidades de plásmido

Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos Métodos químicos: DEAE-Dextrano Coprecipitados de CaPO4 Lípidos cationicos Métodos físicos: Biobalistica Microinyección Electroporación

Objetivo de la transfección Expresión de proteínas para su purificación Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular Estudio de promotores y elementos regulatorios Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. Interacción de proteínas Clonado Terapia génica

Métodos químicos

Métodos físicos: Biobalistica Microinyección Electroporación

Consideraciones para transfección con lípidos cationicos Tansfección en presencia de suero Antibióticos en el medio de cultivo Densidad celular Elección del promotor Cantidad de DNA

Transfección estable y transiente