TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de restricción. Marcadores moleculares: RFLP, SSLP, VNTR (minisatélites y microsatélites), SNP. Secuenciación. Hibridación. Obtención de sondas. Transferencia Northern y Southern. ADNc. PCR. Microarray.
TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR FRAGMENTACIÓN DEL ADN CLONACIÓN AMPLIFICACIÓN DEL ADN SECUENCIACIÓN DEL ADN HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
FRAGMENTACIÓN DEL ADN
CLONACIÓN EN PROCARIOTAS Aislar y multiplicar en tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN
CLONACIÓN DEL ADN
Vector recombinante con el inserto 1 o 2 ADN donante Vector recombinante con el inserto 1 o 2
IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS RECOMBINANTES RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: El plásmido que contiene el gen de la proteína de interés también contiene un gen de resistencia a un antibiótico BACTERIAS “COLOREADAS”: El gen de nuestra proteína se inserta en el plásmido interrumpiendo al gen de una enzima que produce color azul
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
TIPOS DE GELES POLIACRILAMINA: para fragmentos de ADN menores de 500 nucleótidos AGAROSA: para fragmentos de ADN mayores de 500 nucleótidos CAMPO PULSANTE (agarosa): fragmentos grandes de ADN, incluso cromosomas completos
MAPAS DE RESTRICCIÓN
MAPAS DE RESTRICCIÓN
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO PURIFICADO DE ADN * Método Enzimático de Sanger * Método Químico de Maxam y Gilbert
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER
MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER Síntesis in vitro de ADN en presencia de nucleótidos trifosfato terminadores de cadena Secuenciador Automático (+700 nt) A C G T Autorradiografía (300 nt) A C G T
CROMATOGRAMA DE SECUENCIA
MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La hibridación se produce sólomente entre cadenas complementarias ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN, La propiedad de los ácidos nucleicos para hibridar solo con secuencias complementarias proporciona un método muy valioso para encontrar secuencias concretas
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS SONDA: secuencia conocida de ADN o de ARN que es complementaria a la secuencia de interés y que se apareará con ella; se utiliza para localizar secuencias específicas de ADN
SONDAS Marcaje de fragmentos de ADN: sondas altamente marcadas sondas marcadas en 5´ Tipo de marcaje: radiactivo: p32 químico: fosfatasa alcalina, biotina, etc.
SONDAS Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas): Altamente Marcadas Marcadas en 5´ Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas): Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.
ADNc
En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto. Localiza los ARNm en las posiciones precisas que ocupan en las células o tejidos Hibridación “in situ”
Hibridación “in situ” con fluorescencia FISH
SOUTHERN BLOT
Microarrays
MARCADOR MOLECULAR Sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular SNP (polimorfismo de un solo nucleótido): sustitución de un nucleótido por otro SSLP (polimorfismos en la longitud de secuencias simples): variación en el tamaño del fragmento por inserción/deleción VNRT (número variable de repeticiones en tándem): Minisatétiles (centrómeros y telómeros) Microsatétiles (distribuidos por todo el genoma)
LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS (dos alelos por individuo) RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción): Método para la detección de los distintos polimorfismos, mediante la utilización de enzimas de restricción LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS (dos alelos por individuo)
DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP 1, 1 1, 2 2, 2 1 ER ER ER 2 SNP
DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP 1, 1 1, 2 2, 2 1 ER ER ER 2 SNP
PADRE MADRE HIJO Padre Madre Hijo
DETECCIÓN DE VNTR MEDIANTE RFLP 1 ER ER ER ER 1 2 ER ER 2 ER ER
VNTR-microsatélites (2-5 pb)