Replicación del DNA

Mecanismos de replicación celular “Una hebra es el complemento de la otra” Proceso mediante el cual la secuencia de nucleótidos de una hebra de DNA, es copiada por apareamiento de bases complementarias (A-T, G-C) en una nueva secuencia de DNA Se requiere: Reconocimiento de cada nucleótido en la hebra molde, por otro nucleótido libre complementario Separación de las hebras de la doble hélice del DNA Polimerización catalizada por enzima

Replicación es semiconservativa Experimento de Meselson-Stahl Células cultivadas en medio donde la única fuente de Nitrógeno, NH4Cl poseía 15N. Células se transfirieron a medio con 14N y se obtuvo DNA después de una generación. Segunda generación genera don DNA´s híbridos y dos DNA con 14N Preguntas por resolver ¿Las hebras de DNA parentales están completamente desenrolladas antes de ser replicadas? ¿La replicación comienza en lugares aleatorios o en único punto? - ¿Ocurre en una sola dirección?

Replicación del cromosoma de E. coli John Cairns demostró la replicación del cromosoma de E. coli en 1963 Marcó radioactivamente el cromosoma con 3H-Timidina Luego aisló los cromosomas lisando las células suavemente Los observó mediante autoradiografía Se demostró: E. coli tiene un cromosoma circular de 1,7mm de longitud Tiene un único origen de replicación En E. coli cuando se desenrrolla el DNA simultáneamente se da la replicación

Replicación unidireccional o bidireccional? John Cairns con una varió el experimento con 3H-Timidina Cultivó E. coli en medio con 3H-Timidina de baja actividad específica Esperó a que las células estuvieran a la mitad de la replicación Pulsó las células con 3H-Timidina de alta actividad específica Se demostró: El cromosoma de E. coli efectúa replicación bidireccional

Origen de replicación Denaturation mapping Técnica que se basa en la desnaturalización de regiones ricas en T y A DNA con loops de replicación son parcialmente desnaturalizados Se mapean la posición y el avance de las horquillas de replicación Se demostró la existencia de un origen de replicación

Horquilla de replicación En la horquilla de replicación, el DNA de las nuevas hebras hermanas es sintetizado por un complejo multienzimático La polimerización se da por la enzima DNA polimerasa que polimeriza en dirección 5’-3’, descubierta en 1957 No se conoce una enzima que polimerice de 3´a 5´ La horquilla es una estructura asimétrica La hebra en dirección 5’-3’ es polimerizada continuamente y se denomina la hebra líder La hebra hermana hermana que es sintetizada de forma discontinua se conoce como hebra rezagada

Fragmentos de Okazaki Fragmentos de DNA de 1000-2000pb en Procariotes y 100-200pb en Eucariotes Se sintetizan en la hebra rezagada en la dirección 5´-3´ La hebra rezagada debe esperar a que la hebra líder exponga la hebra molde en los cuáles son sintetizados los fragmentos de Okazaki

Inicio de la replicación Modelo de replicón del inicio de replicación Replicador: Set de secuencias que son suficientes para dirigir el inicio de la replicación del DNA Incluye al origen de replicación Proteína iniciadora: Reconoce un elemento de DNA en el replicador que activa la iniciación

Proteínas para abrir la doble hélice La doble hélice de DNA debe ser abierta al frente de la horquilla de replicación Dos proteínas contribuyen en este proceso: DNA helicasas y Single Strand DNA-Binding Proteins DNA Helicasas: Hidrolizan ATP para hacer trabajo mecánico. De esta manera se genera propulsión cuando están ligadas a hebras sencillas de DNA. Al encontrar doble hélice la separan a una velocidad de 1000 nucleótidos por segundo. Single Strand DNA-Binding Proteins: También son conocidas como proteínas desestabilizadoras de la hélice. Se unen fuertemente a DNA de cadena sencilla sin cubrir las bases. Ayudan a las DNA helicasa a mantener el DNA abierto. Adicionalmente impiden la formación de hairpines.

DNA polimerasas Su función principal es catalizar él ataque nucleofílico del grupo hidroxilo ubicado en la posición 3´ del nucleótido ubicado en la hebra que se está sintetizando al fósforo α del deoxinucleótido 5’ trifosfato

DNA polimerasas La enzima tiene preferencia estructural por aquellos nucleótidos que son complementarios Adicionalmente la DNA polimerasa corrige los errores que se puedan generar en la polimerización mediante actividad exonucleasa

Nick translation

Arquitectura de una DNA polimerasa

Resumen del proceso

DNA topoisomerasas Cada 10 pares de bases se completa un giro alrededor del eje central Ocurre un problema de torción La polimerasa rompe el enlace fosfodiester para que las dos secciones del DNA puedan rotar