ESCUELA SUPERIOR DEL LITORAL FACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA Y CIENCIAS DEL MAR “SILENCIAMIENTO DE POSIBLES GENES ANTIVIRALES EN Litopenaeus vannamei Y SU EFECTO EN LA SUSCEPTIBILIDAD AL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV)” TESIS DE GRADO Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida

La charla de hoy I. Introducción: Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ARN de interferencia (ARNi) Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei II. Métodos Resultados: Bioinformática Fenotipos encontrados Conclusiones

Objetivos Identificar, de entre 54 genes candidatos, genes potencialmente involucrados en la respuesta antiviral de L. vannamei usando la técnica de silenciamiento genético (RNAi, siglas en inglés) mediante la inyección de ARN bicatenario (dsRNA, siglas en inglés). Determinar las posibles proteínas codificadas por cada uno de los genes evaluados mediante análisis bioinformático de la base de datos genéticos (NCBI, National Center for Biotechnology Information).

Introducción La industria camaronera representa una de las actividades comerciales de mayor importancia para la economía del Ecuador. El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ha causado en el país grandes mortalidades en cultivos de camarón L. vannamei ocasionando pérdidas económicas sustanciales. White Spot Syndrome Exportaciones Ecuatorianas de Camarón Anual. Fuente: Datos tomados del CNA (Cámara Nacional de Acuicultura).

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) Familia, Nimaviridae Género Whispovirus ADN circular de doble cadena y envoltura lipídica exterior a la nucleocápside 275 nm de longitud y 85 nm de diámetro Morfología de WSSV Virión Núcleo -capside Fuente: Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy Viruses

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) Descripción de la Enfermedad Manchas Blancas Aparición de manchas blancas en la cara interna de la cutícula de los crustáceos Manifestación de signos de estrés Letargia Coloración rojiza Anorexia Natación en superficie Muerte en horas o en unos pocos días Mortalidades altas en cultivo Enfermedad es atenuada a temperaturas altas Transmisión Horizontal Reacción + anticuerpo Tejido sano Tejido infectado (WSSV) Tejido hematopoyetico teñido con Anticuerpos contra WSSV

ARN mensajero degradado Bloqueo de ciclo de vida viral ARN de Interferencia (ARNi) : mecanismo antiviral en camarón 21 a 23 nucleótidos ARN mensajero degradado Bloqueo de ciclo de vida viral

Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei dsRNA Homólogo Respuesta inmune innata Silenciamiento (ARNi)

Criterios para la selección de genes candidatos HIPOTESIS: Para genes importantes en la respuesta antiviral de L. vannamei, la inyección de un dsRNA homólogo a los genes candidatos resulta en una respuesta inmune deficiente en comparación con dsRNAs usados como controles en este estudio. Criterios para la selección de genes candidatos Expresión aumenta en respuesta a una inyección de dsRNA. Expresión aumenta en respuesta a infección con WSSV. Genes importantes para el sistema inmune del camarón

Extracto SPF (control) Genes candidatos 54 genes candidatos Salina (control) dsRNA ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección ADNc Fluorescente Microarray Cuantificación de niveles de expresión,identificación de genes con expresión más abundante en animales inyectados con dsRNA Extracto SPF (control) WSSV ARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección Cuantificación de niveles de expresión, identificación de genes con expresión más abundante en animales infectados con WSSV

Síntesis de ARN de doble cadena (dsRNA) 3’ 5’ ADN ADN purificado kit QIAquick (QIAGEN) dsRNA sintetizado in vitro con ARN polimerasas T3 y T7 400 ug dsRNA (260/280=1.9-2.1) dsRNA inyectado 4 ug/ind. ARN polimerasa T7 ARN polimerasa T3 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ Transcripción Transcripción 3’ 5’ 5’ 3’ Hibridación de las dos cadenas 3’ 5’ ARN de doble cadena

Sistema de Bioensayo: Diseño Experimental Sistema de desafíos individuales CONTROLES TRATAMIENTOS CONTROL POSITIVO (WSSV) CONTROL NEGATIVO (Sol. Salina) CONTROL RESP. ANTIVIRAL (dsRNA-Inespecífico) CONTROL ESPECÍFICO (dsRNA-Sal) dsRNA-WSSV Tamaño de la muestra= 40 Animales ≈ 1 gr.

Estrategia de Análisis: Bioinformático DNA protein-translate ExPASy InterProScan Sequence Search Marine Genomics BIOINFORMÁTICA Nucleotide Blast (NCBI) CAP3 Sequence Assembly Program Blastx(NCBI) Protein Blast (Blastp NCBI) Dominio Funcional Busca el contig (porciones de un genoma completo) en L. vannamei. Busca todos los EST que poseen similitud con el contig. Ensambla todos los EST encontrados y forma un nuevo contig. Traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos en todos los posibles ORF. Valor Expect (<10-6) ; Referencia del ORF correcto. Muestra el dominio funcional para determinar la posible proteína que codifica

Estrategia de Análisis: Estadístico Si el valor de p > 0.05 dsRNA especifico-sal vs Neg. FENOTIPOS DE GENES Mortalidad de cada tratamiento Si el valor de p ≤ 0.05 ESENCIAL dsRNA esp-WSSV vs dsRNA inesp-WSSV I. sucp. + p > 0.05 SIN FENOTIPO Índice de susceptibilidad p ≤ 0.05 I. sucp. - ANTI-VIRAL PRO-VIRAL Tabla de Contingencia

Nº de Acceso del EST en NCBI Nº de Acceso del EST en NCBI Resultados Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo Observado CK725277 Ldla, CLECT lectina tipo C ESENCIAL CK570744 Granulinas CK572129 Proteínas de choque térmicoHsp70 CK571978 Chaperonas CK571718 Vigilin CK570770 DnaJ o J-DnaJ/Hsp40 CK572639 WD40 CK571807 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa CK743206 ATP sintasa subunidad C CK572496 Factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF; Factor de crecimiento endotelial vascular VEGF CK591644 Factor antilipolisacárido Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo Observado CV468236 Sar1 Ras-Like GTPasa ESENCIAL MGID514847 Histona de unión RBBP4 o subunidad C de complejos CAF1 CV468041 Factor de iniciación eucariótico CK571791 Proteínas transportadoras MGID513560 Proteosoma C-terminal de la subunidad reguladora CK739385 Helicasa con dominio DEAD CK572488 ADN helicasa putativa MGID515874 sin dominio funcional MGID515663 CK572424 CK571864

Nº de Acceso del EST en NCBI Nº de Acceso del EST en NCBI Resultados Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo Observado CK572677 Dominio SWIB MDM2 SIN FENOTIPO CK591233 Dominio SWIB MDM3 CK591012 Inositol polifosfato quinasa CK591345 Dominio catalítico,alfa amilasa, alfa, alfa-phosphotrehalase CK591327 sin dominio funcional CK591655 CK725284 CK572442 CK572120 CK591121 CK571145 CK990141 CK572416 CK571262 CK571457 CK572105 Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo Observado CK571943 Tiolasa SIN FENOTIPO CK591675 Dominio de unión al ARN CK591701 Cofactor tubulina vinculante C CK571271 Peroxidasa hemo CK572760 Catepsina D CV133220 TB2/DP1 Familia HVA22 CK591002 Acetil-CoA-Crotonasa/enoil-coenzima A (CoA) CK571502 Familia Peptidasa (M20, M25 y M40) CK592593 Peroxirredoxinas, thiorredoxinas CK572962 Dominios relacionados con el fibrinógeno CV468320 Peptidasa C1A CK572708 ATPasa CK571517 Cadherinas CK592250 Ribosomal L7Ae CV468393 Mesd

Nº de Acceso del EST en NCBI Resultados Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo Observado CK725515 Peptidasa C1A PRO-VIRAL

Discusión-Conclusiones Uno de los 54 genes estudiados presentó un fenotipo de potencial interés (posible gen pro-viral). El 41% de los genes evaluados fueron esenciales para la supervivencia del camarón, aún en ausencia de infección experimental Encontrar genes antivirales tiene aplicación en la selección de camarones más resistentes a enfermedades. Identificar genes antivirales tiene relevancia para comprender a nivel molecular los mecanismos antivirales en el camarón.

Discusión-Conclusiones El silenciamiento con dsRNA (ARNi) representa un método promisorio para la evaluación funcional de genes candidatos.

Recomendaciones En base a los resultados, se recomienda realizar más bioensayos en busca de genes antivirales en L. vannamei realizando réplicas para cada tratamiento. Confirmar los fenotipos identificados en este y en futuros trabajos mediante la cuantificación de los niveles de ARN de los genes bloqueados Realizar análisis a nivel histológico de animales que presentaron alta mortalidad en ausencia de WSSV (fenotipo esencial).

Agradecimientos FINANCIAMIENTO: MUSC-USA BIOGEMAR-EC ESPOL: Ph.D. Javier Robalino (Director de Tesis) Ph.D. Marcelo Muñoz Ph.D. Washington Cardenas BIOGEMAR: Ing. Walter Intriago Msc. Ricardo Cedeño CENAIM: Lcda. Irma Bentancourt Ph.D. José Melena

Gracias =)