Dra EMMA GUERRERO HURTADO CINETICA ENZIMATICA Dra EMMA GUERRERO HURTADO

CINETICA QUIMICA Cinética Química es aquella parte de la Química que se encarga de estudiar la velocidad de una Reacción Química y los factores que permiten su control. Se limita a : Reacciones Reversibles

CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS Según el número de moléculas: A P A + B p A + B + C P

SEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓN R. Primer Orden: A P V= -d A= K (A) dT R. Segundo Orden: A+ B P V= -dA = -dB ó + dP dT dT dT V= K (A) (B)

CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teória para explicar la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima, en función a la concentración del sustrato. La concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como función de [S]. La expresión de Michaelis-Menten Vo = Vmax [S] Km + [S]

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema : Sacarosa Glucosa + Fructosa Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales a)(E) variable y (S) constante b)(E) constante y (S) variable invertasa agua

A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimática Vo & (E) Vo (E)

B) Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción ------------------------------------------------------- Vo 1/2 Vmax KM Sustrato (S)

= Constante de Michaelis -Menten Se supone: E + S ES ES E + P KM = Constante de Michaelis -Menten Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reacción Vmax = Cuando el enzima se halla saturado

Como se relacionan Vmax, Km y Vo? Observemos : * K1 K3 E + S ES E + P K2 K4 Que hay un solo sustrato Que la velocidad K4 se desprecia * Que la concentración del E es muy pequeña * Que la E puede estar como: E libre y ES * Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que K3, por lo que éste es limitante determina, o limita, la cantidad de producto formado

POR LO QUE... LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA: VO = K 3(ES) LA ECUACION RESULTANTE SERA: VO =Vmax.(S) (S) + Km Ecuac. Michaelis Menten

.-1) Cuando [S] es igual que Km: La dependencia de la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuación de Michaelis-Menten como sigue: .-1) Cuando [S] es igual que Km: vo= Vmax*[S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = Vmax Km + [S] [S]+ [S] 2[S] 2 2) Km= K2 + K3/ K1 Si K2>> K3 Km =K2/K1 K m= (E) (S) K = (E) (S) (ES) ES)

SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA Vmax= K3 (ET) # de recambio K3= número de moléculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada

NÚMERO DE RECAMBIO Carboxipeptidasa 102 Tripsina 102 a 103 Cinasas 103 Deshidrogenasas Transaminasas Anhidrasa carbonica 106 Superoxido dismutasa catalasa 107

DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S] Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S] Se simplifica: 1 = Km * 1 + 1 vo Vmax [S] Vmax La ecuación de la recta es: y = a * x + b

La ecuación de la recta es: y = a * x + b donde: y = 1 y x = 1 Vo [S] El valor de Km puede ser hallado a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la intersección negativa de x.

y = a * x + b 1/Vmax -1/Km

INHIBICION ENZIMATICA ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

INHIIBIDORES Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E + I EI ES + I ESI 2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima: E + I E’

INHIBICIÓN REVERSIBLE (a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, IMPIDIENDO LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO: Inhibición Competitiva (b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO IMPIDE LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

Inhibición Competitiva S ES E + P I Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor: [E] [I] Ki = [EI] EI Características: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato. - El inhibidor es tan específico como el substrato

Por tanto, en la inhibición competitiva, 1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble 1/Vmax -1/Km -1/(Km(1 + i/Ki))

Succinato deshidrogenasa Inhibidores competitivos Succinato deshidrogenasa

Inhibidores competitivos como ánalogos estructurales del substrato

Inhibición No Competitiva ES EI I S E + P ESI Inhibición No Competitiva El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

INHIBICION NO COMPETITIVA E + I EI I + ES ESI

El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad.

DROGA USO TERAPEUTICO ENZIMA AFECTADA TIPO DE INHIBICION Lovastina Hipercolestero lemia HMGCoA reductasa Competitiva 5fluoroacil cancer Dihidrofolato reductasa competitiva alopurinol gota Xantino oxidasa irreversible cumadin anticoagulante Glutamilcar boxilasa captopril hipertensión ECA

concepto de Análogo de Estado de Transición (AET) - El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción. - La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Estado de transición Substrato Análogo de estado de transición

EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN LAS INTERACCIONES ENTRE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO SON ÓPTIMAS

E + I E’ INHIBICIÓN IRREVERSIBLE - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente E + I E’ El efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosfóricos 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, (a) Agentes alquilantes Yodoacetato (b) Compuestos insaturados N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2 (c) Formadores de mercáptidos p-Hidroximercuribenzoato (d) Oxidantes Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos DFP: diisopropil - Actúan sobre enzimas serínicas fluorofosfato - Actúan sobre enzimas serínicas - Únicamente sobre la Ser activa - Insecticidas: Parathion, Malathion - Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinación de metales Es el caso del ion cianuro, CN- Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior. Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

SUBSTRATOS SUICIDAS (Inhibidores activados enzimáticamente) - Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola Tienen por tanto : (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

E + I EI EI* E’ + I* Modo de acción de los inhibidores suicidas 1 2 3 1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional 2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

INHIBIDORES SUICIDAS, - SISTEMA DE LA b-LACTAMASA BACTERIANA La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas, sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió- ticos b-lactámicos.

Penicilina (activa) b-Lactamasa Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida de la b-lactamasa, el ácido clavulánico b-Lactamasa Ác.clavulánico Esta molécula reacciona con la serina activa de la b-lactamasa, produciendo su inactivación

- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL Los estados depresivos, en general, están relacionados con un descenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos (dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del cerebro. Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4). Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea como terapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos inhibidores suicidas de la MAO

Noradrenalina Monoamino oxidasa La MAO es una flavoproteína: tiene un grupo prostético flavínico (FAD) fundamental para la catálisis. Los inhibidores suicidas de la MAO inactivan al cofactor FAD. Dihidroxifenilglicol

N,N’ dimetil propargilamina (pargilina) Flavina Inhibición suicida de la MAO mediante Pargilina Flavina modificada

CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES 1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple Azahar: A +E AE A E + B AEB B+ E BE BE + A BEA

2) ORDENADA MALATO + NAD OXALACETATO + NADH. E-NAD-MALATO 1 2 M.D

2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO ASPARTATO + OXOGLUTARATO OXALACETATO + GLUTAMATO 1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + Oxalacetato 2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + Glutamato

qué son las moléculas efectoras o moduladoras ? Son moléculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) de la velocidad catalítica. No cambian la afinidad del enzima por el sustrato. Pueden ser el mismo sustrato denominado HOMOTROPICO o es otra sustancia al que se le conoce como HETEROTROPICO

1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato. ES DIFERENTE A LAS ENZIMAS ANTES VISTAS? ¡SI!! PORQUE LOS E.A. PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE UNION DE LIGANDOS: 1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato. 2.- Las reguladoras (Centro Alostérico) a las que se unen las moléculas denominada efectores o moduladores.

ENZIMAS ALOSTERICAS S S EF EF CA C.ALOST. ENZIMA

CINETICA SIGMOIDEA La unión cooperativa de la primera molécula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad de unión de subsecuentes moléculas de sustrato a los otros sitios de unión: cooperatividad positiva

ENZIMAS ALOSTERICAS Enzimas susceptibles de ser modificadas por moléculas pequeñas.

ESTADO CONFORMACIONAL Baja afinidad por el sustrato R Alta afinidad por el sustrato

MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS MODELO CONCERTADO: RR TT RR

MODELO SECUENCIAL : RT TT + S + S RR