Transporte de solutos y agua Curso ME 2012 Fisiología Humana Dra. Adriana Suárez , MSc.

Temas de la clase Guía estudio: objetivo, lecturas, laboratorio, ATP Importancia La membrana celular, compartimentalización, semipermeabilidad Clasificación de mecanismos de transporte Difusión simple Difusión facilitada Transporte activo: primario, secundario

Guía de estudio Objetivo: Resolver problemas de transporte en los organismos vivientes que incluyan: conceptos de difusión simple y facilitada, ósmosis, transporte activo: primario, secundario y terciario, así como los sistemas de transporte masivo: endocitosis, exocitosis y arrastre por solvente. Lectura: Capítulo 5: “Transport of solutes and water” en: Boron W.F. & Boulpaep E.L. (2009). Medical physiology. 2nd ed. Philadelphia: SAUNDERS. Laboratorios: “Difusión” y “Osmosis y Permeabilidad en el eritrocito”. ATP: Problemas y casos

Importancia ¿Cómo se mantiene el equilibrio osmótico entre los compartimientos del LEC y del LIC? ¿Cómo se mantienen las concentración de Na+ y K+ intracelular en un estado “estacionario”: 15 mM y 120 mM respectivamente? Cómo se regula la fluidez de las secreciones mucosas? Cómo regulan las células su volumen?

Membranas están compuestas por lípidos (fosfolípidos principalmente) y proteínas y pequeña cantidad de carbohidratos. Modelo del Mosaico fluido. Espesor 5-8nm. Son semipermeables. Figure 3-4

Figure 5-4

Transporte pasivo no acoplado a través de una membrana: soluto se mueve siguiendo su gradiente electroquímico Es pasiva. Utiliza la energía cinética de los movimientos moleculares. El flujo neto se da a favor de un gradiente electroquímico. Se da hasta llegar al equilibrio donde el flujo neto es de cero. Se da rápidamente en cortas distancias Se relaciona en forma directa a la temperatura Se relaciona en forma inversa al tamaño molecular y a la viscosidad del medio El soluto (sin carga, hidrofóbico) puede atravesar la bicapa lipídica. La membrana es permeable a ese soluto.

Ley de Fick simplificada (aplica para partículas sin carga eléctrica): Jx (mol/cm2 . s) = Px ([X]o - [X]i)= (cm/s)(mol/cm3) Px (coeficiente de permeabilidad de X) incluye: 1. Coeficiente de partición: liposolubilidad del soluto 2. Coeficiente de difusión del soluto (D): tamaño molecular (r), temperatura (T), energía térmica de la molécula, viscosidad del medio () 3. Grosor y área de la membrana

Transporte mediado Proteínas integrales de membrana median y regulan transporte de solutos polares (no liposolubles): poros, canales, acarreadores ó transportadores, bombas. 1/6 parte de los genes del genoma humano codifican para proteínas acarreadoras ó transportadoras. Puede ser pasivo (difusión facilitada) o activo (primario, secundario).

Transporte pasivo a través de proteínas integrales de membrana: poros, canales iónicos, acarreadores Poros: Siempre están abiertos. Canales: Alternan entre un estado cerrado, abierto e inactivo. Tienen compuertas (gating). Selectividad para iones es variable. Acarreadores: “Compuertas nunca abiertas al mismo tiempo”. Transportan solutos como la glucosa y la urea (difusión facilitada). Sustancia transportada queda “ocluida” en algún momento dentro del acarreador. Transporte se da a favor de gradiente electroquímico

Ejemplos: Porinas: en bacterias gram negativas y en membrana externa de mitocondria. Perforinas: liberadas por linfocitos T citotóxicos. Se insertan en membrana de la célula blanco. Complejo de poros nucleares: en la membrana nuclear. Formados por hasta 30 diferentes proteinas. Aquaporinas: En membranas celulares de diferentes tipos de células. Poros

Acuaporinas Permeabilidad de las membranas al agua depende de la densidad de acuaporinas. Hay 11 diferentes descritas (2002) Hay acuaporinas constitutivas (AQP1,AQP3, AQP4) y reguladas (AQP2, túbulo colector, ADH). Se dividen en: 1. Grupo de las acuaporinas: AQP1, 2, 4, 5, 6, 8. 2. Acuagliceroporinas: por ellas puede pasar agua, glicerol, urea.

Acuaporinas (AQPs) AQP1: 28 kDa. Tetrámero. Cada monómero tiene 269 aa con 6 dominios TM. AQP 1: Poro mide 2.8 Å, Radio del agua 2.8 Å. Poro interacciona mediante enlaces de hidrógeno con agua.

ADH y acuaporinas (AQP2) en membrana apical del epitelio del túbulo colector

Difusión facilitada: Transporte pasivo mediado por acarreador ó transportador. A favor de gradiente electroquímico Cambios conformacionales reversibles.

Superfamilia de acarreadores de solutos (SLC) Incluye a todos los acarreadores que no hidrolizan ATP directamente y no se relacionan con una cadena de transporte de electrones. Hay 43 familias En cada familia hay entre (1 y 27) variantes con diversos grados de homología. Difieren en mecanismo de transporte (difusión facilitada, cotransportadores, intercambiadores), cinética (afinidad y especificidad), mecanismos de regulación, localización, cuando se expresan en el desarrollo.

Table 5-4. Some Families in the SLC Superfamily of Solute Carriers Description Examples SLC1 (7) Glutamate transporters EAAT1 SLC2 (14) Facilitated transport of hexoses GLUT1, GLUT4 SLC3 (2) Heavy subunits of heterodimeric amino acid transporters (with SLC7)   SLC4 (10) bicarbonate exchangers and cotransporters AE1 (Cl-HCO3 exchanger) NBCe1 (electrogenic Na/HCO3 cotransporter) NBCn1 (electroneutral Na/HCO3 cotransporter) NDCBE (Na+-driven Cl-HCO3 exchanger) SLC5 (8) Na+/glucose cotransporters SGLT1 to 5 (glucose) SLC6 (16) Na+- and Cl--coupled cotransport of "neurotransmitters" B0AT1 (Na+-coupled amino acid) GAT1-3, GBT1 (Na+- and Cl--coupled GABA) ATB0+ (Na+- and Cl--coupled amino acids) SLC7 (14) Transporter subunits of heterodimeric amino acid transporters (with SLC3) SLC8 (3) Na-Ca exchangers NCX1 to 3 SLC9 (9) Na-H exchangers NHE1 to 8 SLC10 (6) Na/bile salt cotransporters SLC11 (2) H+-driven metal ion cotransporters DMT1 SLC12 (9) Cation-coupled Cl- cotransporters NKCC1, NKCC2 (Na/K/Cl cotransporter) NCC (Na/Cl cotransporter) KCC1 (K/Cl cotransporter) SLC13 (5) Na+-coupled sulfate and carboxylate cotransporters NaDC1 (mono-, di-, and tricarboxylates) NaSi (sulfate) SLC14 (2) Facilitated transport of urea UT SLC15 (4) H+-driven oligopeptide cotransporters PepT1

Table 5-4. Some Families in the SLC Superfamily of Solute Carriers Monocarboxylate transporters MCT1 (H+-coupled monocarboxylate cotransporter) TAT1 (facilitated diffusion of aromatic amino acids) SLC17 (8) Type I Na/phosphate cotransporters and vesicular Glu transporters NaPi-I SLC18 (3) Vesicular amine transporters   SLC19 (3) Folate/thiamine transporters SLC20 (2) Type III Na/phosphate cotransporters NaPi-III SLC21 (11) Organic anion transporters OATP PGT SLC22 (18) Organic cations, anions, zwitterions OCT1 to 3 (facilitated diffusion or organic cations) OAT1 to 5 (exchange or facilitated diffusion of organic anions) URAT (urate exchanger) SLC23 (4) Na/ascorbic acid transporters SLC26 (10) Multifunctional anion exchangers DRA (Cl-HCO3 exchanger) Pendrin (exchanges bicarbonate, Cl-, or I-) CFEX (exchanges Cl-, bicarbonate, oxalate, formate) SLC28 (3) Na/nucleoside transporters SLC34 (3) Type II Na/phosphate cotransporters NaPi-IIa, NaPi-IIc SLC36 (4) H+-coupled amino acid cotransporters PAT1 SLC38 (6) Na+-driven neutral amino acids (system A and N) SNAT3 (cotransports amino acids with Na+ in exchange for H+) System N (cotransports amino acids with Na+ in exchange for H+) SNAT1, 2, 4 (system A cotransports amino acids with Na+) SLC39 (14) Metal ion transporters ZIP1 (uptake of Zn2+) SLC40 (1) Basolateral Fe transporter* Ferroportin (MTP1, Fe2+) SLC42 (3) NH3 channels RhAG *Facilitated diffusion.

Tasa de transporte depende de [X] No se satura Tasa de transporte depende de [X] El flujo máximo (Jmax) se da cuando el sistema se satura. Sistema es específico Sistema se puede inhibir: competitivo/no competitivo Acarreador tiene Km (menor Km, mayor afinidad)

Clasificación de los más conocidos transportadores o acarreadores de glucosa (GLUTs, SLC2). Son selectivos, uniportadores Transportador Localización Características GLUT 1 Mayoría de tejidos del cuerpo: eritrocitos, glia, endotelio, BHE Glucosa y otras hexosas Constitutivo GLUT 2 Hígado y páncreas, intestino y riñón Alta Km (poca afinidad) GLUT 3 Neuronas Glucosa y otras hexosas. Baja Km (alta afinidad) GLUT 4 Tejido adiposo y músculo esquelético Regulado por insulina. En membrana de vesículas. GLUT 5 Intestino, espermatozoides, Riñones. Transporta fructosa. Poca afinidad para glucosa. GLUT 6 Secuencia que no codifica GLUT 7 Intestino delgado y colon. Testículos y próstata. Transporta glucosa y fructosa.

Estructura propuesta para los GLUT PM: 46 000 12 dominios transmembrana

Transporte mediado por acarreadores puede ser regulado: GluT4 e insulina

Transportadores de urea (SLC14 (2) UT) Urea: O = C (NH2) 2, PM 60, radio 2 Å, polar, baja solubilidad en lípidos, baja permeabilidad por bicapa lipídica. UT-B: glóbulos rojos: Antígeno Kidd; vasos rectos renales. UT-A1: en epitelio túbulo colector medular. Expresión regulada por ADH (mem. Apical) UT-A2: DDAH (delgada descendente asa Henle) Proteinas altamente reguladas: pueden fosforilarse: PKA, PKC, TK, glicosilarse.

Comparación entre poros, canales y acarreadores Acarreadores, canales y poros tienen estructura física similar: tienen dominios transmembrana que rodean zona por donde pasa el soluto. Algunos acarreadores también tienen canales incorporados. En algunos canales hay zonas de interacción del soluto con el canal. Pueden saturarse.

Transporte Activo Contra gradiente electroquímico, requiere de energía. (ATP ó gradiente de concentración). Primario (directo): utiliza energía liberada al hidrolizar el ATP. Se les llama “bombas”. Secundario (indirecto): utiliza la energía potencial de un gradiente. Se acopla el movimiento de un soluto a favor de gradiente con el movimiento de otro en contra de gradiente. Crea estado de desequilibrio Proteína transportadora requiere energía para cambios de conformación.

Transporte activo primario (bombas): ATPasas de transporte P ATPasas (E1-E2): forman intermediarios fosforilados estables que se pueden aislar. Ej.: Na+ /K+ ATPasa; bombas Ca+2 ó Ca+2 ATPasas; bombas H+-K+ V ATP asas: vacuolares: H+-ATPasas F ATPasas: mitocondrias (F1-F0) Además los Transportadores tipo ABC

Na+K+ ATPasa (bomba de Na+-K+) cotransporte activo primario Ubicua. Electrogénica. P-ATPasa. 1alfa, 1 beta, 1 gamma Subunidad alfa (4 isoformas): tiene actividad catalítica Subunidad beta (3 isoformas): inserción de subunidad alfa a membrana. Subunidad : proteína FXYD2: modula afinidad por K+, Na+ y ATP Generalmente en memb. basolateral Na+K+ ATPasa (bomba de Na+-K+)

E2: sitios de unión para iones abiertos hacia afuera de la célula. E2-P: Se bloquea con glicósidos cardíacos: ouabaina, digoxina. Hipocalemia potencia toxicidad. E1: sitios de unión de iones abiertos hacia el lado intracelular

H+K+ ATPasa (HKA): P2c-ATPasa Células parietales de glándulas gástricas, riñón, intestino. Estequiometría: 2H+:2K+:1ATP. Electroneutra. Tiene una subunidad alfa y una beta (con similitud a subunidades de Na+ K + ATPasa). Inhibida por omeprazole.

Otras P-ATPasas: Ca+2 ATPasas SERCA: S/ER Ca+2 ATPasa: ATPasa tipo P2A. 1ATP: 2 Ca+2: 2 H+ . Hay 3 isoformas: Musc. Esq. Rápido: SERCA1; Musc. Esq. Lento y corazón: SERCA 2a; Musc. Liso SERCA2b. Tapsigargina: inhibidor específico de las SERCA. PMCA: Plasma membrane Ca+2 ATPasa. P2B. Por lo menos 4 isoformas. 1H+/1Ca+2/1ATP. Funciona en paralelo con el intercambiador NCX Es 10x más lento que el intercambiador. Tiene mayor afinidad por el calcio que el intercambiador.

SERCA PMCA Intercambiador Na+/Ca+2

PMCA Codificada por 4 genes: PMCA 1-4. 1ATP: 1 Ca+2: 1 H+ Afinidad por calcio aumenta al unirse con complejo Ca+2 -CAM. Su Km disminuye. PL: sitio de unión a fosfolípidos P: sitio de fosforilación. Aumenta actividad al fosforilarse. Se inhibe con lantano y vanadato. SERCA no.

SERCA Con cuatro dominios citoplasmáticos: cuello, cuerda beta, unión del nucleótido, fosforilación. Hay 3 isoformas clonadas: SERCA1: músc. Esquelético rápido. SERCA 2a: corazón, músc. Esquelético lento. SERCA 2b: músc.Liso, tej. no musc. Tapsigargina: inhibidor específico. Fosfolamban: regula SERCA en músculos. Desfosforilado inhibe la SERCA.

ATPasas tipo V: H+ ATPasas: vesículas (lisosomas, endosomas, ves secreción), borde apical epitelios: riñón, intestino.

Transportadores tipo ABC (ATP binding cassette) Tienen un motivo que liga nucleótidos (NBD1 y NBD2). Pueden actuar como bombas, canales ó reguladores de canales y de acarreadores. Son 7 subfamilias (ABCA-ABCG) con 49 miembros

Table 5-6. ABC Transporters Subfamily* Alternative Subfamily Name Examples ABCA (12) ABC1 ABCA1 (cholesterol transporter) ABCB (11) MDR (multidrug resistance) ABCB1 (MDR1 or P-glycoprotein 1) ABCB4 (MDR2/3) ABCB11 (bile salt export pump, BSEP) ABCC (13) MRP/CFTR ABCC2 (multidrug resistance-associated protein 2, MRP2) ABCC7 (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR) ABCC8 (sulfonylurea receptor, SUR1) ABCC8 (SUR2) ABCD (4) ALD ABCD1 (ALD, mediates uptake of fatty acids by peroxisomes) ABCE (1) OABP ABCE1 (RNASELI, blocks RNase L) ABCF (3) GCN20 ABCF1 (lacks transmembrane domains) ABCG (5) White ABCG2 (transports sulfated steroids) ABCG5/ABCG8 (heterodimer of "half" ABCs that transport cholesterol) *Number of genes in parentheses.

Subfamilia ABCB (11): MDR (multidrug resistance transporters) Son ATPasas (transporte activo primario) MDR1: es una glicoproteína: saca metabolitos catiónicos y drogas de las células. Se ven en el hígado, riñón y TGI. Contribuye a que células cancerosas se hagan resistentes a quimioterapia al sacar de la célula a éstas drogas.

CFRT (ABCC): (cystic fibrosis transmembrane regulator) Con sitios de fosforilación por PKA y PKC Unión del ATP controla la apertura y cierre del canal

ABCC(13): ABCC7: CFRT (cystic fibrosis transmembrane regulator) Sufre mutación en la fibrosis quística. Es una glicoproteína (170 kDa) en membrana apical y basolateral de muchos epitelios Es un canal de Cl- y un regulador de otros canales Iónicos (ej.: ENaC). ATP regula el canal de dos formas: fosforilación, interacciones con NBD. CFTR fosforilado se activa. Luego depende del ATP para el “gating”: apertura o cierre del canal.

Transporte activo secundario: mayoría son cotransportadores (sinporter), intercambiadores (antiporter): NO utiliza ATP directamente. Lo más frecuente es aprovechar el gradiente del Na+ para transportar otros solutos en contra de gradiente electroquímico.

Transporte activo secundario y la Na+- K+ ATPasa Bomba mantiene el gradiente de sodio. El gradiente de sodio se utiliza en formar un gradiente de otro soluto.

Cotransportadores Ambos solutos se mueven en la misma dirección. Na+ dependiente: El sodio puede ser cotransportado con muchos solutos: glucosa (SLC5), aa (SLC6 y SLC38), mono,di,tricarboxilatos (SLC13), aniones inorgánicos (fosfatos NaPi,sulfatos, bicarbonato NBC), iones: (Na+/K+/2Cl- NKCC; Na+/Cl NCC; K+/Cl- KCC) H+ dependiente: Acoplado a gradiente de H+: H+/oligopéptidos (SLC15), H+/monocarboxilato (SLC16), H+/cationes divalentes (SLC11) (hierro, Cd++,Pb++)

SGLUT (SLC5 (8)) Na+ y D-glucosa ó galactosa se unen al transportador desde el mismo lado de la membrana Se ven en epitelio intestinal y renal SGLT2 y SGLT3: 1 Na+ : 1 glucosa SGLT1: 2 Na+ : 1 glucosa Es electrogénico, es saturable Tienen 14 TM

Capacidad de concentración para la glucosa con el SGLT2: 1 Na+: 1 glucosa [glucosa]i/ [glucosa]o= [Na+]o/ [Na+]I x 10 –Vm/(60mV) Si afuera de la célula hay 10x más sodio que adentro, y la célula tiene un Vm de -60mv entonces: 10x101= 100 Esto quiere decir que la glucosa logrará estar hasta 100 x más concentrada adentro que afuera. ATP: Calcular lo mismo para el SGLT1: 2 Na+ : 1 glucosa

Na+/HCO3- cotransportador, NBC, familia SLC4 En membrana basolateral de epitelios está el NBC electrogénico (NBCe1/e2). Estequiometría 1Na+/3 HCO3- Se da salida de HCO3- hacia el LEC. En otras células puede funcionar 1Na+/2 HCO3- . Entra bicarbonato a la célula. NBCn1/n2 electroneutro. Estequiometría: 1Na+/1 HCO3-

Transporte de Cl- acoplado a cationes: SLC12 (9): 1. Variantes de NKCC: NKCC1 (SLC12A2): en células no epiteliales y en membrana basolateral de células epiteliales. NKCC2 (SLC12A1): en membrana apical de células de la RAGAH. Inhibido por furosemida y bumetanida (diuréticos de asa) NCC: En membrana apical del túbulo contorneado distal. Se bloquea por diuréticos tiazidas. KCC: Saca cloruro y potasio de la célula a favor de gradientes electroquímicos.

Intercambiadores (antiporters) Solutos transportados van en direcciones opuestas.

Intercambiador Na+/Ca+2 (NCX, SLC8 (3)) Saca calcio usando gradiente del sodio. Hay 3 isoformas: NCX 1-3. NCX 1: En músculo cardíaco. Con 9 TM. Transporta 3 Na+/ 1Ca+2. Permite mantener el calcio 10 000 x más concentrado en LEC. Es electrogénico. Se puede regular por fosforilación.

Intercambiador Na+/H+, NHE, SLC9(9) Es un contratransporte. Es no electrogénico: 1 Na+/ 1 H+ Presente en casi todas las células. 9 isoformas. Importante en la reg. del pH intracelular. En riñones es imp. en reabsorción de sodio y excreción renal de H + Los H+ intracelulares regulan el transportador en un sitio diferente al usado para el transporte. Puede hacer que el pH intracel. suba hasta 8.4 Normalmente pH intracel. está alrededor de 7.2

Intercambiadores aniónicos, AE1-AE3 (HCO3/ Cl-), SLC4 ó SLC 26 Importantes en eritrocitos (AE1) No electrogénico. Estequiometría 1:1 Importante en secreción de bicarbonato y en regulación del pH intracelular y volumen celular.

Bomba Na+-K+: Mantiene gradientes de sodio y potasio; contribuye con el potencial de membrana de reposo; contribuye con la regulación del volumen celular; importante en la absorción de nutrientes; mantiene excitabilidad de células. Calcio: adentro hay 10 000x menos que en el LEC. Su fuerza electromotriz es muy grande hacia adentro de la célula. Puede entrar por canales voltaje dep. Es sacado activamente por bombas. A concentraciones fisiológicas sale por PMCA.

Cloruro: en mayoría de células tiende a salir en forma pasiva Cloruro: en mayoría de células tiende a salir en forma pasiva. No se encuentra en equilibrio ya que entra activamente por medio de NKCC y AE. Por medio del K+-Cl- KCC1 (SLC12) tiende a salir. Los H+ entran en forma pasiva a la célula y el HCO3- sale en forma pasiva de la célula. No están en equilibrio ya que los H+ son sacados por los NHE (SLC9) y el bicarbonato es metido por el NDCBE (SLC4) (sodium driven Cl-bicarb. Exchanger).