FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR Y APLICACIONES

Contenido del Curso Introducción a la Electroforesis Capilar (EC). Fundamentos de EC Modalidades de separación por EC. Principales variables y respuestas en EC. Desarrollo de Métodos por EC. Problemas y soluciones Aplicaciones

INTRODUCCIÓN

Introducción Es una de las técnicas de separación más utilizadas en el primer mundo. De gran importancia en el análisis y purificación de biomoléculas Los científicos que trabajan con material de origen biológico han tenido la necesidad de separar y examinar las propiedades de moléculas con peso molecular alto, tales como proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, lípidos, complejos y carbohidratos, y para hacerlo es necesario no dañarlas o mantener sus propiedades de tal forma que no sean modificadas significativamente. Esto es lo que nos lleva al mejoramiento de equipo y el desarrollo de nuevas técnicas.

Introducción Descripción de migración debida a la aplicación de un campo eléctrico 1a vez Reuss 1809 Corriente eléctrica Bateria Cátodo Ánodo El termino electroforesis fue citado por primera vez en 1809 por Reuss en las memorias de la Sociedad Imperial Natural (Moscow) Arena

Introducción Michaelis sugiere el nombre de electroforésis (1909) Anie Tiselius perfecciona un instrumento para llevar a cabo la electroforesis de zona (1937) Empleo de tubos capilares para mejorar la disipación del calor, DI 1-3mm, giraban en su propio eje para ser enfriados. Hjertén electroforesis capilar.(1967) Hjertén describe lo que en el mundo entero se conoce como los principios de la electroforesis capilar en tubo abierto, tubo de cristal con recubrimiento de metilcelulosa, para prevenir el flujo electroosmótico

FUNDAMENTOS

Electroforesis Es la migración de especies cargadas que se encuentran disueltas o suspendidas en un electrolito, por influencia del campo eléctrico, de esta manera los cationes migran hacia el electrodo negativo (cátodo) y los aniones migran hacia el electrodo positivo (ánodo). 2. FUNDAMENTO

Electroforesis Capilar… Es la migración de especies cargadas por influencia del campo eléctrico que se encuentran disueltas o suspendidas en un electrolito. Electroforesis Tradicional Técnica analítica instrumental de separación, que permite la identificación y cuantificación de analitos en muestras que tienen una matriz compleja. Usando el principio de la Electroforesis convencional. 1. DEFINICIÓN Electroforesis Capilar

Electroforesis convencional cátodo ánodo Electroforesis convencional Electrophoresis is a bi-directional process that involves charged particles

Electroforesis Capilar Fuente de alimentación de voltaje Detector Compartimento termostatizado Capilar de sílice fundida Esquema básico de un equipo de Electroforesis Capilar Adquisición De Datos Entrada del capilar Electrodo Electrodo Salida del capilar Reservorio Reservorio

Principios básicos de EC El entorno dentro del capilar Analito (muestra) Buffer (medio) Campo eléctrico Pared del capilar

Principios básicos de EC Influencia de las propiedades del analito Entorno Analito (muestra) Tamaño y forma Carga neta Masa Buffer (medio) Campo eléctrico Pared del capilar

Principios básicos de EC Influencia de las propiedades del medio Entorno Analito (muestra) Buffer (medio) Fuerza iónica Temperatura pH Viscosidad Constante dieléctrica Campo eléctrico Pared del capilar

Efecto de la temperatura Calor de Joule. Ya que una corriente eléctrica pasa a través del capilar esta se convierte en calor. Este depende también del diámetro interno del capilar y el ambiente externo. Un gradiente de temperatura es generado de manera radial

Efecto de la temperatura Calor de Joule excesivo Incrementa la mobilidad aproximadamente 2%/ºC Incrementa el ancho del pico Puede producir micro-burbujas las cuales serán detectadas como picos falsos. El buffer puede hervir, causando una caída de corriente debido a la interrupción de la conductividad

Métodos de control

Principios básicos de EC Influencia de las propiedades del campo eléctrico Entorno Analito (muestra) Buffer (medio) Campo eléctrico Voltaje aplicado Longitud Fuerzas conductoras Pared del capilar

CE Fundamental Equations Terminology Detector Ld Length to Detector Capillary Inlet Reservoir Capillary Outlet Reservoir Lt Total Capillary Length

Fuerza del campo eléctrico E = Campo eléctrico E = V/Lt V = Potencial aplicado (Volts) Lt = Longitud total del capilar (cm)

Velocidad Electroforética nep= Velocidad nep = Ld/tm Ld = Longitud efectiva (cm) tm = Tiempo de migración (s)

Movilidad Electroforética nep= Velocidad electroforética mep = nep/E E = Campo eléctrico

Flujo electrosmótico

Principios básicos de EC Influencia de las propiedades del capilar Entorno Analito (muestra) Buffer (medio) Campo eléctrico Pared del capilar Carga superficial Recubrimiento Flujo electrosmótico

El capilar Vidrio Cubierto permanentemente con polimida La superficie interna puede encontrarse cargada La carga en la superficie puede ser manipulada Responsable del flujo electroosmótico

Ionización de los silanoles Los grupos silanol son fácilmente ionizables cerca del pH 4. La pared del capilar estará cargada negativamente La cantidad de cargas es controlada por el pH del buffer.

Parámetros importantes en EC Fuerza del campo eléctrico Velocidad electroforética Movilidad electroforética Efecto del pH del buffer Efecto del campo eléctrico E=V/L E campo eléctrico, V voltaje aplicado (volts), L longitud total del capilar (cm)

Flujo electrosmótico

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - MOVILIDAD ELECTROOSMÓTICA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - OH O - pH alto Si Si pH bajo mEO mEO - FEO

+ - MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA Y ELECTROOSMÓTICA mEO mEO mEO mEF mEF Vt Vt Vt ANALITOS NEUTROS CATIONES ANIONES tm < tm < tm

Perfil de velocidad electrodinámica (flujo laminar) El Perfil de flujo Perfil de velocidad electroosmótica Perfil de velocidad electrodinámica (flujo laminar)

El flujo electroosmótico FEO El FEO permite: Migración de analitos neutros Migración de aniones hacia el cátodo Separación de aniones y cationes en una misma corrida Mejorar y controlar la resolución

Control del FEO El flujo electrosmótico puede ser controlado, modificando el pH de la solución amortiguadora de separación, con el fin de: Obtener mejor resolución Reproducir los tiempos de migración

Flujo electroosmótico La intensidad del FEO puede disminuirse: Al trabajar a pH < 4 Al agregar al buffer de separación un solvente orgánico. Al adicionar un surfactante catiónico al electrolito soporte.

Flujo electroosmótico El FEO puede ser eliminado permanentemente, si se modifica la pared del capilar o temporalmente, recubriendo la pared del capilar con algún polímero adicionado al electrolito soporte. El FEO puede ser invertido.

Parámetros que afectan al FEO Campo eléctrico pH del buffer Fuerza iónica o concentración del buffer Temperatura Modificadores orgánicos Surfactantes Cubrimientos covalentes Polímeros hidrofílicos neutros

TIPOS DE SEPARACIÓN

Tipos de separación Electroforesis capilar de Zona (ECZ) Electrocromatografía Capilar (ECC) Cromatografía Electrocinética capilar (CECM) EC en gel o redes poliméricas (ECG) Isoelectroenfoque Capilar (IEC) Isotacoforesis (ITF).

CZE

ISOELECTROENFOQUE CAPILAR Se usa un capilar neutro empacado con algún gel. Se administran anfolitos generado un gradiente de pH dentro del capilar. La muestra se prepara en un medio que permita tenerla con carga eléctrica y se inyecta en el capilar. Los compuestos se separan de acuerdo a su PI, al aplicar un potencial. Detección en línea

PRESIÓN ISOELECTROENFOQUE CAPILAR + - + + + - + + - - - + + Señal - - - + + Señal Tiempo de migración

EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS Técnica muy usada en biología para la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Las moléculas se separan al moverse a través de una red de polímero que actúa como tamiz molecular. Las moléculas grandes poseen una trayectoria más obstaculizada que las pequeñas, por lo que su tiempo de migración es mayor.

EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS El proceso es similar a la electroforesis en gel de poliacrilamida, pero con las ventajas de usar un capilar. En un inicio se usaban geles anclados que se reportó, proporcionan hasta 23 millones de platos teóricos. Actualmente se usan redes poliméricas (polímeros líquidos).

EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS Señal Tiempo de migración

EC EN GELES O REDES POLIMÉRICAS Matrices de Polímeros para ECG Polímero Aplicación Crosslinked polymers Poliacrilamida Oligonucleotidos, Secuenciación de ADN, Proteínas SDS Polímeros Lineales Poliacrilamida, Polivinil alcohol, dextran Fragmentos de restricción Oligonucleotidos, Secuenciación de ADN, Proteínas Agarosa Proteínas

CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR

+ CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR Permite la separación de compuestos neutros (q=0) o con movilidades electroforéticas muy similares. La separación se debe a diferencias en la movilidad electroforética y a diferencias en interacciones con la fase pseudoestacionaria que presenta cada compuesto. + s s s Porción hidrofílica Porción hidrofóbica s

CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR Es una técnica híbrida entre la cromatografía líquida de alta resolución y la electroforesis Capilar. El solvente es transportado por medio del flujo electrosmótico y no por presión como en HPLC. El empaque usado puede usarse con tamaño de partícula menor (0.5-2 micras).

Permite la separación de analitos neutros y con carga. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR Permite la separación de analitos neutros y con carga. Es posible manipular la selectividad del proceso al variar la composición de la fase móvil y de la estacionaria.

Electrocromatografía Capilar - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + - + + - + + - - + + + - + + + +

Aplicaciones

APLICACIONES Fármacos, Análisis Clínicos. MOLÉCULAS DE INTERES BIOQUÍMICO. Fármacos, Análisis Clínicos. Productos Naturales, Industria Alimentaria. Quelatos Metálicos Contaminantes Explosivos Isómeros

APLICACIONES MOLÉCULAS DE INTERÉS BIOQUÍMICO: Prótidos, Aminoácidos, Amino-azúcares. Péptidos Ácidos Nucleicos Purinas y Pirimidinas, Nucleósidos Nucleótidos y Oligonucleótidos Fragmentos de DNA.

Perfiles proteínicos en leche

Pesos Moleculares de proteínas

Eritropoyetina Análisis de Isoformas según Farmacopea Europea. Applying the European Pharmacopoeia Capillary Zone Electrophoresis Method for the Separation of Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO). Aplicación técnica Beckamn Coulter. En www.beckman.com

Pureza Heterogeneidad Identidad EC PARA LA EVALUACIÓN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS Y VACUNAS Pureza Heterogeneidad Identidad

MEJOR RESOLUCIÓN Y CUANTIFICACIÓN Minutes 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 min 6 8 10 12 mAU 5 25 30 35 40 45 4 3 2 kD 200 6 116.3 97.4 1 66.3 55.4 6 5 These data show one of the key benefits of CE over SDS-PAGE. Same samples of Ab were loaded on both and resolved. 1=light chain, 2-4=impurities, 5=NG HC, 6=HC NG HC is resolved from HC by CE but not by SDS-PAGE. Quantitative data regarding these bands is also obtainable. 4 36.5 3 31 2 1 21.5 CE-SDS reduced / UV (220nm)

RESOLUCIÓN DE IMPUREZAS EN IgG The highly resolving nature of the SDS-gel polymer allows for the ability to separate degradation variants from one another. Data shows various isoforms of Ab in both reduced and non-reduced states. Non-reduced state gives multiple combinations of light and heavy chain Ab.

RESOLUCIÓN DE IMPUREZAS EN VACUNAS

Polisacáridos en vacunas

Más de IgG

Hirudina Separación de r-hirudin de una muestra proveniente de un fermentador. Muestra de r-hirudin purificada.

HORMONA DE CRECIMIENTO Separación de hormona del crecimiento humana recombinante. natural

Glicanos

| Análisis de virus completos Detector de Fluorescencia

Otra aplicaciones. Separaciones Quirales

Drogas de abuso

Orina

Cabello

Residuos de Disparo

Polvora

Análisis Genético

Gracias