Modelo tridimencional de AH (Schulten- Schinitzer, 1997).

Simulación por computación de la adsorción arcilla arcilla arcilla humus Simulación por computación de la adsorción de la antrazina en un AH (Akim- Bailey, 1998)

Modelo de Ácidos Húmicos (Adaptado de Schulten y Schnitzer,1993) Modelo de Ácidos Húmicos Grupos funcionales, Estructuras Aromáticas y Alifáticas

Modelo de SH y la asociación SH-arcilla y SH- iones metálicos (Orlov, 1986) 2+

Micela de AH ATKINS,1998 CADENAS HIDROFÓBICAS (FILAMENTOS) GRUPOS HIDROFÍLICOS Impacto de los métodos de caracterización en el estudio de las Sustancias Húmicas.

Técnicas analíticas aplicadas a las SH se dirigen a conocer: Composición, estructura, propiedades. Tiempo de residencia en la naturaleza. Interacciones con otros componentes inorgánicos del suelo. Interacciones con sistemas de microorganismos. Interacciones con sistemas biológicos de plantas. Potencialidades como sistemas depuradores de agentes contaminantes. Propiedades y efectos sobre sistemas naturales de las sustancias compostadas. Impactos (toxicología) de su presencia en las aguas y del tratamiento de éstas al purificarlas.

Material Orgánico MÉTODOS QUÍMICOS DE CARACTERIZACIÓN DE S, HÚMICAS EXTRACCIÓN Y FRACCIONAMIENTO. Material Orgánico Interacción Fracción orgánica Fracción mineral Material humificado SH (AH, AF; H) Residuos orgánicos (material veg. no descompuesto o parcialmente descompuesto) Biomasa viva (material org. protoplasma de organismos) Separar: Física (M.Densimétricos) (M. Granulométricos) Química (solventes)

Extracción de MO del suelo por por varios solventes. MÉTODOS QUÍMICOS DE CARACTERIZACIÓN DE S, HÚMICAS EXTRACCIÓN Y FRACCIONAMIENTO. Condiciones que debe cumplir el solvente para la extracción de las SH: Sin poseer alteraciones en su estructura. No presentar contaminantes inorgánicos como arcillas o cationes polivalentes. Completamente, siendo representativas de todas las fracciones de distintas MM presentes. Aplicable a todo tipo de muestra. Extracción de MO del suelo por por varios solventes. Sustancias extraída Extrayente %MO Sustancias Húmicas NaOH 80 Na2CO3 80 Na2P2O7 30 NaF 30 NaAc.org: 30 Acetilacetona 30 Cupferron 50 8-Hidroxiquinolina 45 Ácido Fórmico 55 Acetona-agua-HCl 20

Influencia del método de extracción sobre las Sustancias Húmicas. (Garcés, 1987)

(precipitación ácido- básica) Kononova- Belchikova (1961) M. Orgánico (1:20) Na4P2O7 +NaOH (0.1 mol/L) HCl pH (2- 3) Extracción (T 25 0C - 270C) Filtración o centrifugación AHc AFc (Reposo 24h) Filtración al vacío Purificados (precipitación ácido- básica) Columna (C act.) HCl 5%: HF (1:1) Diálisis Liofilizados AF1 (amoníaco) AF2 (acetona) Método Kononova- Belchikova (1961) (Garcés,1987)

Espectrofotrométricos MÉTODOS QUÍMICOS DE CARACTERIZACIÓN DE S, HÚMICAS EXTRACCIÓN Y FRACCIONAMIENTO. DETERMINACIÓN DE CARBONOS ORGÁNICOS Vía seca Oxidación C org. (1000 0C) O2 Vía húmeda Walkly - Black Tiurin (Simakova) Métodos Gravimétricos Volumétricos Espectrofotrométricos Cromatrográficos CO2 %CMO, %CSH, %CAH, %CAF

"Determinación de la M.O. en el Vermicompost y fraccionamiento de las Sustancias húmicas por el método de Kononova – Belchikova” (Ruiz, 1999) Muestra %C %N C/N %Mat. Org. SHc AFc %C AHc AHc/AFc RC E.V.1 21.41 1.85 11.57 36.9 11.71 a 9.81 a 1.9 a 0.19 E.Co 1 mes 20.36 1.76 35.1 12.28 a 10.58 a 1.7 ab 0.16 RA E.V1 20.0 1.73 11.56 34.5 11.37 a 9.57 a 1.8 a 0.18 E.Ca 3 mes 22.3 1.92 11.61 38.4 7.16 b 5.73 b 1.43 bc 0.24 E.V 3 meses 21.4 12.51 a 11.16 a 1.35 c 0.12 Sx = 0.25 0.033 0.035 0.016 C.V. = 2.6% 4.9 % 5.5 % 6.4 % P < 0.05

MÉTODOS QUÍMICOS DE CARACTERIZACIÓN DE S, HÚMICAS EXTRACCIÓN Y FRACCIONAMIENTO. DETERMINACIÓN DE CARBONOS ORGÁNICOS COMPOSICIÓN ELEMENTAL ANÁLISIS DE SUSTANCIAS NITROGENADAS ANÁLISIS DE GRUPOS REACTIVOS ( COOH, OH-FEN, OH-ALC, C=O, OCH3, QUINONAS) HIDRÓLISIS ( H2O, ÁCIDA, ALCALINA ) DEGRADACIÓN POR OXIDACIÓN DEGRADACIÓN POR REDUCCIÓN FORMACIÓN DE COMPLEJOS Y QUELATOS DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE CAMBIO CATIÓNICO ESTUDIO DE PROPIEDADES COLOIDALES MEDICIÓN DE INTERACCIONES ORGANO-MINERALES UMBRALES DE COAGULACIÓN

REACC. TÍPICAS P/ DETERMINAR G.CARBONILOS. *POR FORMACIÓN DE OXIMAS , HIDRAZONAS, CARBAZONAS . H + - H O C=O + N H -O H C NHOH 2 C = NOH + H O 2 2 OH HIDROXILAMINA OXIMAS + H - H O C=O + N H -O H C NHNH 2 C=N-NH-C H + H O 2 6 5 2 FENILHIDRACINA FENILHIDRAZONA SCHNITZER ,1972 Vb VOL. CONSUMIDO BLANCO Vs vol cons. Muestra N conc.del ácido (Vb -VS) N 106 CARBONILO = ________________ mg MUESTRA

Reacción con el dimetil sulfato para determinar OH totales R-OH + NaOH = RO-+ Na+ +H2O RO- + CH3-O-SO2-O-CH3 = ROCH3 + CH3-O-SO2-O- Leenheer y Noyes (1989) (CH3)2SO4 + K2CO3 Schnitzer (1974) (CH3)2SO4 + K2CO3(ACETONA)

2 R-COOH + CaAc2 = (R-COO)2Ca 2 +HAc DETERMINACIÓN DE G. CARBOXILO . 2 R-COOH + CaAc2 = (R-COO)2Ca 2 +HAc RECUPERAR HAc X DESTILACIÓN con arrastre de vapor HOLTZCLAW Y SPOSITO (1979) Valoración potenciométrica indirecta EXTRAER HAc x ultracentrifugación (SCHNITZER,1972) NO USAR BASE INT: NaAc. (PERDUE Y COL.,1980) (Vm-Vb)N.106 Cont.COOH(cmole/Kg) = _______________ mg MUESTRA

DE G.CARBOXILO + FENILHIDROXILOS DERTERMINACIÓN DE G.CARBOXILO + FENILHIDROXILOS F.ORTEGA ACIDEZ TOTAL AH MAS POPULAR Ba(OH)2 N2 AH + Ba(OH)2 AH AH Ba(OH)2 Ph >13 VALORAR POT. HCL CaAc2 AH + NaOH (SCHNITZER) VALORAR POT. X NEUT. NaOH G. CARBOXÍLICO (G. I Y II A) (STEVENSON) STADNIKOV Y COL (1929,34,35) VALORAR NaOH REPOSO HUMATOS (KUJAUNKO,1937) BaCL2 FULVATOS VALORACIÓN HCL 0.1N (ANÁLISIS X ESPECTROMETRÍA INFRARROJA) (DRAGUNOVA,1958)

Grupo: -OH = Ácidez total - -COOH CARACTERIZACIÓN DE LOS AHC Grupos Funcionales Ácidez total (-COOH y –OH fen) con Ba(OH)2 Stevenson, (19) -COOH con CaAc2 Schnitzer, (1972) (Val. Pot. Neut.). Grupo: -OH = Ácidez total - -COOH Schnitzer y Gupta (1965)

Grupo: -OH = Ácidez total - -COOH CARACTERIZACIÓN DE LOS AHC Umbral de coagulación Kononova, (1966) Grupos Funcionales Ácidez total (-COOH y –OH fen) con Ba(OH)2 Stevenson, (19) -COOH con CaAc2 Schnitzer, (1972) (Ruiz. 1999) (Garcés,1987) 7.46% CV p< 0.05 4 Sx 56a EV3m RA 36 FR ECa3m RA 40 RR 40b EV1a RA HcC 60a ECo1m RC 18 PcC EV1a RC UC (mmol CaCl2/L ) Mues UC (mmol(+) CaCl2/L humato Muestra (Val. Pot. Neut.). Grupo: -OH = Ácidez total - -COOH Schnitzer y Gupta (1965)

E. Región Ultravioleta - visible (UV) E. Infrarroja (IR) M. Espectroscópicos E. Región Ultravioleta - visible (UV) E. Infrarroja (IR) Resonancia magnética nuclear (RMN) Resonancia paramagnética electrónica (EPR) MÉTODOS FÍSICOS DE CARACTERIZACIÓN DE SUSTANCIAS HÚMICAS M. Isotópicos Enriquecimiento con C14 y C13 Marcador con N15 y disolución isotópica N15 Determinación de MM Isoterma de absorción Viscosimetría Sedimentación Cromatografía de gel Diálisis Osmometría Análisis de grupos finales Temperaturadecongelación Peso equivalente Determinaciones electrométricas Potenciometría Conductrimetría Polarografía

INTERPRETACIÓN DE LOS CORRIMIENTOS QUÍMICOS EN C13-RMN DE SH -Carbono alifático (alc. + ácidos grasos) 0-39 ppm -C de proteinas, péptidos, amino ác. Y metoxilos 40-60 -C de carbohidratos 61-105 -C aromáticos 106-165 -C de fenoles 150-165 -C de carboxilos 170-190 -C de carbonilos (cetonas) 210-230 % Carácter alifático - % Carácter aromático

Espectros UV de los AH de los suelos de Cuba (Garcés, 1987)

Espectros UV de los AHc de losVermicompost. (Ruiz, 1999) AH5 AH4 AH3 AH2 AH1

Espectros UV- visible de los AH y AF del Liplant (Caro, 2004) Anillos Aromáticos sustituidos E4/E6 (AH sc) = 3.9 - 4.7 (AH Vc) = 4.8 – 5.3 E4/E6 (AF sc) = 7.8 - 14.1 Fracción Pg

Espectros IR de los AH del Liplant (Caro, 2004) Ö(C=C) Est. aromáticas 1507-1512 2700-2400 cm-1 Ö(C-H)-COOH 3440 cm-1 Ö(C-H) A.Carboxílicos, fenoles, alcoholes 2850-2921 cm -1 Ö(C-H) -CH2, -CH3 610 d(C-H) C.aromáticas +sustituyentes 3100 - 3000 cm-1 Ö(C-H) Est. aromáticas 1419 cm-1 Ö(C-H) -CH2, -CH3 1125 Ind.Pureza (COO-M) 1640-1628 Ö(Mc-c=o) -COOH 1740-1600 Hongos Actinomicetos 3200 cm-1 Ö(N-H) amidas, aminas 1628-1616 Ö(C=N) G.Hetrocíclicos Ö(C-N) aminas amidas 1704-1710 Ö(O-C=O) ésteres,-COOH cetonas y quinonas Ö(COO-) 1088-1034 carbohidratos +Ö(Si-O) ä C-H Cad. Aromáticas con sustituyentes 1263-1220 Ö(C-O), Ö(C-OH) ésteres, arilésteres,fenoles,alcoholes Ö(C-O) - OHfen, d(OH) Ö(C=O) amida ó Ö(C=O) cetonas y quinonas

AH AF (Caro, 2004) Espectros FTIR 1039 Carbohidratos, polisacáridos Ö(C=O) amida Ö(COO-M) Ö(C-O) -OHfen,Ö(COO-) , d(C-H), d(OH) Ö(N-H) amidas, aminas

E. Región Ultravioleta - visible (UV) E. Infrarroja (IR) M. Espectroscópicos E. Región Ultravioleta - visible (UV) E. Infrarroja (IR) Resonancia magnética nuclear (RMN) Resonancia paramagnética electrónica (EPR) M.Complementarios Técnicas temodegradativas Electroforesis Microscopía electrónica de varredura Análisis de la composición elemental MÉTODOS FÍSICOS DE CARACTERIZACIÓN DE SUSTANCIAS HÚMICAS M. Isotópicos Enriquecimiento con C14 y C13 Marcador con N15 y disolución isotópica N15 Determinación de MM Isoterma de absorción Viscosimetría Sedimentación Cromatografía de gel Diálisis Osmometría Análisis de grupos finales Temperaturadecongelación Peso equivalente Determinaciones electrométricas Potenciometría Conductrimetría Polarografía

E. Región Ultravioleta - visible (UV) E. Infrarroja (IR) M. Espectroscópicos E. Región Ultravioleta - visible (UV) E. Infrarroja (IR) Resonancia magnética nuclear (RMN) Resonancia paramagnética electrónica (EPR) M.Complementarios Técnicas temodegradativas Electroforesis Microscopía electrónica de varredura Análisis de la composición elemental MÉTODOS FÍSICOS DE CARACTERIZACIÓN DE SUSTANCIAS HÚMICAS M. Isotópicos Enriquecimiento con C14 y C13 Marcador con N15 y disolución isotópica N15 Determinación de MM Isoterma de absorción Viscosimetría Sedimentación Cromatografía de gel Diálisis Osmometría Análisis de grupos finales Temperaturadecongelación Peso equivalente Determinaciones electrométricas Potenciometría Conductrimetría Polarografía

AF1 AF1 AF1 AH 5 2 1 3 4

SH (Suelos de Cuba) (Garcés, 1987) Extracción óptima 25- 270C, solvente: Na4P2O7 + NaOH AH semejantes a los AF de otras regiones, con acidez total baja AF con características más acentuadas y acidez total semejante Estructuras más sencillas , menos condensadas y polimerizadas, siendo más oxidados. IR, UV para los AH y AF, se encontraron estructuras aromáticas y alifáticas, OH fenol, -COOH (ionizado o no), C=O, amina, amida, polisacáridos.

(Vermicompost Cubano) SH (Vermicompost Cubano) (Ruiz, 1999) No se obtuvieron diferencias marcadas entre los vermicompost con diferente tiempo de maduración, sustrato, lombriz. SH de características fulváticas y estabilizadas biológicamente al 1 mes,con predominio de grupos OH fenol sobre los –COOH,de MM, condensación y polimerización relativamente baja. Los AHc de los vermicompost presentan una acidez semejante a los AF de los suelos, dada fundamentalmente por la presencia de -OH fenólicos y grupos -COOH , los cuales junto a los grupos carbonilos y amidos determinan la posibilidad de elevado cambio catiónico y formación de complejos y quelatos. Se encuentran en un estadío intermedio e/ residuos vegetasles y AH de suelos pero con relaciones atómicas que lo definen como AF más evolucionados. IR, UV para los AHc , se encontraron estructuras aromáticas y alifáticas, OH fenol, -COOH (ionizado o no), C=O, amina, amida, polisacáridos.

SH Humus Líquido LIPLANT (Caro, 2004) Con extrayente menos enérgico se pudo obtener una fracción más sencilla con características más fulváticas y oxidadas, con MM. de las fórmulas empíricas semejantes a los AHv y rel- H/C elevada, lo que denota su estructura menos condensada, predominando las est. Alifáticas, con alto contenido de N y S provocado por la autolisis celular de la flora microbiana, con %MO (36,2), %SH (25,82), %AF (13.09), AH/AF (0.98) IR, UV para los AH y AF, se encontraron estructuras aromáticas y alifáticas, OH fenol, -COOH (ionizado o no), C=O, amina, amida, polisacáridos.

"Acidez y grupos funcionales de los ácidos húmicos de los Vermicompost (cmol(+)/Kg)" (Ruiz,1999) Stevenson, 1982 Garcés, 1987 (suelos tropicales) Muestra Acidez Total Grupos -COOH Grupos -OH fen. RC E.V. 1año 620 d 180 a 440 e E.Co 1 mes 740 c 560 d RA E.V 1 año 160 b 580 c E.Ca 3 mes 1100 a 920 a E.V 3 meses 860 b 680 b Sx = 5 4.52 4.10 C.V. = 0.62 % 2.57 % 0.64 % P < 0.05

MASAS MOLECULARES (AH) Valor (D) Método 1000 984 - 1294 1336 1684 1392 5000 - 7000 4500 - 26000 10000 - 200000 ~25000 ~36000 47000 - 53800 Destilación Isotérmica Análisis Grupos Finales Peso Equivalente Temperatura de Congelamiento DRX Diálisis Cromatografía de gel Sedimentación Viscosidad Osmometría

FOTOGRAFÌA ELECTRÓNICA DE LOS AH (Garcés, 1987) Partículas Globulares (Racimos) Polímeros moleculares (100-200nm) Enrejado por uniones sucesivas cilíndricas Empaquetamiento de láminas moleculares muy fina (grosor < 100 nm)

FOTOGRAFÌA ELECTRÓNICA DE LOS AH (Garcés,1987) Uniones sucesivas Glóbulos deformados Zona de concentración más difusa (partículas individuales) Empaquetamiento (formando capas con huecos) Estrellas polidentadas (malla compacta)

Composición elemental de los AH de los diferentes Vermicompost. (Ruiz,1999) EV 1aRC Eco1aRA EV1aRA ECA3mRA EV3mRA