Organización genética y regulación

Regulación + Ausencia de sustrato Presencia de sustrato ARN-Polimerasa ADN Gen Ausencia de sustrato Regulador ADN Gen Presencia de sustrato ARN-Polimerasa Regulador + ARN Proteínas

Genes Reguladores ARN-Polimerasa Gen ADN ARN Ribosomas Proteínas Operón Proteínas

pWW0 Tra/Rep C L H J K B R F M A T J C O tnpA I (Tn4653 ) G N S X tnpT tnpS G 117 kb B H res E xylR H tnpA I Operón xylS (Tn4561 ) F upper V Operón D F meta Q G E D D J XhoI A C E EcoRI P HindIII A Tn4653 Tn4651

• Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca) pWW0 P. putida mt-2 • Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca) • Mutagénesis al azar • Mapeo y localización de los mutantes (secuenciación) • Análisis bioquímico: identificación de gen-función U W C M A B N xyl Operón upper X Y Z L T E F G J Q K H I S R Operón meta Organización genética

Regulación de la expresión Determinar actividades en células creciendo en distintos medios: No-sustrato de la ruta (acetato) Sustratos de la ruta upper Sustratos de la ruta meta Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato - - - - Tolueno + + + + Bencilalcohol + + + + Benzoato - - + + 3-metilbenzoato - - + + Acetato + Tolueno + + + +

TODAS las actividades son inducibles Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta meta Sustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper como a la ruta meta Mutante PaW210: Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato - - - - Tolueno - - - - Bencilalcohol - - - - Benzoato - - + + 3-metilbenzoato - - + + Ruta upper NO es inducible Ruta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta

? Esquema de regulación XylS XylR     + + benzoatos xylS xylR xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu Pm upper meta tolueno   + Reguladores XylR ?

Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas Fusiones transcripcionales Huésped heterólogo (Escherichia coli) Promotor Gen marcador desprovisto de promotor propio xylS xylR Pm:: ‘lacZ E. coli E. coli (pKT570, pJLR107) Inductor Actividad -galactosidasa Ninguno - 3-metilbenzoato + Xyleno + • Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta

Expresión de XylS en P. putida mt-2 Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor Expresión de XylS en P. putida mt-2 P. putida (pWW0) Inductor niveles de mRNA de xylS Ninguno 10 3-metilbenzoato 10 Xyleno 100 xileno xylS 3-metilbenxzoato ninguno Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS

XylS XylR      + Pr1 Pr2 xylR Ps1 xylS xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu      tolueno benzoatos Ps2 Pm upper meta Reguladores XylR XylS

XylS XylR      32/38 - + 54 70 IHF Pr1 Pr2 xylR xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu   -    tolueno 54 IHF Ps2 benzoatos Pm upper meta Reguladores 70 XylS XylR Ps1 xylS BenR

Reguladores XylR C • Activa a los promotores Pu y Ps • Es dependiente de 54 (familia NtrC) • Reprime su propia expresión • IHF activa en Pu y reprime en Ps • En Ps HU es necesaria • Requiere activación por un efector • Represión dependiente de la presencia de otras fuentes de C

Perfil de efectores A B C D Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT CH2OH CH3 CH3 NO2 Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT XylR 180 XylR6 1150 XylR49 1500 XylR7 150 XylR49-7 70 1050 1900 2600 900 1000 2900 3550 950 90 450 3000 A B C D 85 Pro  Ser 135 Asp Asn 172 Glu Lys

C C C Activación de un regulador A Regulador XylR Reprimido Deleción A ADP + Pi ADP + Pi C ATP ATP Activado por el efector (desreprimido) Constitutivo O‘Neill & al., 1998

Represión catabólica Sistema PTS CRC? Otro? Cultivo contínuo Tasa de dilución (h-1) Expresión de la ruta upper Cultivo contínuo (limitación de C) 0.05 0. 5 0.75 Crecimiento Expresión de la ruta upper Inductor Medio rico Limitación Expresión de la ruta upper Cultivo contínuo (0.05 h-1) C O2 N P S Sistema PTS CRC? Otro?

Elementos que participan en la regulación 54-polimerasa xylS xylR XylR IHF 70-polimerasa Elementos que participan en la regulación XylR Activa Reprime IHF Facilita Impide 54 + Efector + ¿ Represor?

Expresión de la ruta meta Reguladores Crecimiento Expresión de la ruta meta Inductor 32 38 XylS • Activa al promotor Pm • Pertenece a la familia AraC • Es dependiente de 32 y 38 • Requiere activación por un efector Extremo N-terminal C-terminal a1 a2 a3 a4 a7 a6 a5

XylS X Pm :: ‘lacZ - 39 2FBz 343 Bz 6369 3FBz 6801 2MBz 2724 4FBz 2886 Efector Actividad Efector Actividad - 39 2FBz 343 Bz 6369 3FBz 6801 2MBz 2724 4FBz 2886 3MBz 13452 2ClBz 141 4MBz 3377 3ClBz 9034 2,3DMBz 6491 4ClBz 2991 2,4DMBz 1737 2,6DClBz 397 2,5DMBz 4093 3,5DClBz 381 2,6DMBz 383 2BrBz 547 3,4DMBz 4630 3BrBz 5372 3,5DMBz 385 4BrBz 1726 X

XylS Pm :: tet • Mutagénesis química de XylS (NTG) • Selección de resitencia a Tetraciclina: - Constitutiva. - Inducible por distintos efectores. • Identificación del residuo mutado Extremo N-terminal C-terminal Motivo HTH-1 Motivo HTH-2 a1 a2 a3 a4 a7 a6 a5 Unión del efector

XylS/Pm:lacZ wt 8000 -galactosidase (Miller U) 4000 rpoS rpoH 2 4 6 8 Time (h)

- 32 + DnaKJ Respuesta HS Proteínas desnaturalizadas estress NO estress - Promotores dependientes de 32 32 +

32 + DnaKJ Respuesta HS Proteínas desnaturalizadas estress Promotores dependientes de 32 32 +

3-metilbenzoato -Galactosidase (Miller U) Respuesta a choque térmico 3-metilbenzoato -Galactosidase (Miller U) PrpoDhs-lacZ

38 + 32 - 54 70 HS XylS Pm FtsH XylR Pu (XylR) IHF Fase estacionaria 32 38 XylS XylR (XylR) Pm + Pu COOH benzoato CH3 tolueno HS 70 FtsH 54 IHF Limitación anabólica -

Incidencia sobre otras poblaciones Consecuencias • Represión catabólica: MEZCLAS • Activación del regulador: INDUCIBILIDAD La inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas: - Enzima(s) no reconocen el sustrato - El regulador no reconocen al inductor, no se activa la ruta • Plásmido % células TOL+ 100 50 tiempo benzoato o-xyl tolueno Transferible Incidencia sobre otras poblaciones Tol tiene además 2 transposones! Inestable Retrotransferencia

TOL TOD TOM TBU T4MO P. putida mt-2 P. putida F1 B. cepacia G4 R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1

     + + - + - Cromosoma (ruta orto) P. putida mt-2 benABC(DKEF) PbenA benR PbenR   benzoato XylS + catBCA PcatB catR PcatR +   - cis,cis-muconato  pcaK pcaF pcaTB(DC) pcaR PpcaR b-cetoadipato + - PpcaK PpcaF PpcaT pcaIJ PpcaI

-P P-   + A B C1 X D R* F E I G H C2 tod T S cromosoma tolueno P. putida F1 TOD A B C1 X D R* F E I G H C2 tod T S cromosoma todXFC1C2BADEGIH todST PtodX PtodS  P-  -P + tolueno Tolueno dioxigenasa meta Reguladores

  + 54 tbm A B C D E F plásmido Burkholderia sp. JS150 TOM Tolueno 2-monooxigenasa plásmido tbmABCDEF PtbmA tb4m  tolueno  tbmR 54 + Regulador Tolueno/benceno 2-monooxigenasa Tolueno 4-monooxigenasa

Tolueno 3-monooxigenasa Ralstonia pickettii PKO1 TBU B tbu A1 U V A2 C T X D R S F E W I K G J H cromosoma Operón meta Tolueno 3-monooxigenasa Fenol hidroxilasa Proteína de membrana tbuR tbuS tbuA1UVBVA2CT PtbuA1 tbuX PtbuX 70? 54  JIKGFEW tbu PtbuW tbuD PtbuD ANR?  tolueno    + meta Tolueno 3-monooxigenasa regulador Fenol hidroxilasa Proteína de membrana Reguladores

p-cresol metilhidroxilasa p-hidroxibenzaldehído P. mendocina KR1 T4MO C tmo A B D E F pcuCAB pobA cromosoma Tolueno 4-monooxigenasa p-cresol metilhidroxilasa + p-hidroxibenzaldehído deshidrogenasa p-hidroxibenzoato hidroxilasa

D C A B S R tdi bss ? E tut tutB A D B C E G F I H bbs fdx had oah dch Thauera aromatica K172 D C A B S R tdi bss reguladores bencilsuccinato sintetasa ? E tut tutB A D B C E G F I H bbs fdx had oah dch bcr B A D C benzoilCoA reductasa

Bencilsuccinato sintetasa Thauera aromatica K172 -P P- tolueno   + PtdiS tdiSR PbssD bssDCAB Reguladores Bencilsuccinato sintetasa

Características de la regulación En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno: INDUCIBLES Reguladores del tipo de 2 componentes Sometidos a represión catabólica Anaerobias facultativas Expresión reprimida en presencia de O2 AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.