Ciclo de Krebs y Bioenergética BIOQUÍMICA Año 2014 GLS

Las 3 Etapas de la Respiración Oxidación metabólica de sustratos orgánicos 1. Generación de grupo acetilo del ACETIL~CoA, desde PIRUVATO, ÁCIDOS GRASOS (mitocondria), o AMINOÁCIDOS (citoplasma/mitocondria). 2. Oxidación de los carbonos del acetilo en el CICLO DE KREBS (mitocondria). 3. Pasaje de electrones de la oxidación en un segundo paso a través del sistema de TRANSPORTE DE ELECTRONES para obtener ATP en la FOSFORILACIÓN OXIDATIVA.

Fosforilación Oxidativa PROTEÍNAS POLISACÁRIDOS GLICÉRIDOS 1° Etapa AMINOÁCIDOS GLUCOSA GLICEROL + AG 2° Etapa PIRUVATO MITOCONDRIA ACETIL-CoA CO2 H+ 3° Etapa (NADH, FADH2) ADP + Pi Fosforilación Oxidativa ½O2 ATP H2O

Grupo alimenticio Unidad metabolizada Transformación convergente Carbohidratos Glucosa ENERGÍA en ATP Grasas (Lípidos) Ácidos grasos Proteínas Aminoácidos

ACETIL-CoA

VIDEO 1 http://www.youtube.com/watch?v=NS9uHH-oZNw

Animales, plantas y muchos microorganismos en condiciones aeróbicas Fermentación a Lactato en esfuerzos musculares, eritrocitos, otras células y algunos microorganismos Fermentación a Alcohol en levaduras - O2 + O2

Glucólisis, Pentosas-P, Transaminaciones Transaminaciones, Βeta-oxidación, Ciclo de Krebs, Cad. Respiratoria y Síntesis de ATP

CÓMO SE MANTIENE LA RELACIÓN NADH /NAD+ ?

TRENES DE H+ para NADH CITOPLASMÁTICO - REOXIDACIÓN NADH+H+ NAD+ Di-HO-ACETONA-P---------------> GLICEROL-3P FAD+ Glicerol-3P-DH (Citosol) Di-HO-ACETONA-P Gli-3-P-DH (Mitocondrial) FADH2 NADH + H+ Malato Oxalacetato  Aspartato Ca++ [200mM] +K+ Acil-S-CoA (+) (-) ADP ATP AA, Malato, Succinato, Piruvato Translocasas NAD+, NADH, FAD HS-CoA

CICLO DE LOS ACIDOS TRICARBOXILICOS Papel central en el metabolismo. Reacciones individuales. Estequiometría y rendimiento energético. Regulación.

Piruvato Piruvato Quinasa Piruvato Descarboxilasa Las Enzs que actúan s/ el Piruvato son: Piruvato Quinasa Piruvato Descarboxilasa Piruvato Deshidrogenasa Lactato Deshidrogenasa Piruvato Carboxilasa Transaminasas Piruvato Final de la glucolisis Inicio de la gluconeogénesis. Fermentación = a lactato , etanol, AGV…. Algunos AA se degradan a Piruvato; y éste da origen a: alanina, cisteína, glicina, serina, treonina, y triptofano.

Descarboxilación Oxidativa del Piruvato 1) Descarboxilación exergónica y fijación del resto acilo a la TPP-Enz 2) Formación de sulfoester de alta Energía con Lipoato 3) Transtiolación isoergónica del acetilo desde el Lipoato a la HS-CoA Enzima Cosustrato prostético Sustrato soluble Piruvato deshidrogenasa ó Pir. descarboxilasa E1 TPP = Tiamina pirofosfato Dihidrolipoil transacetilasa E2 Lipoamida Coenzima A Dihidrolipoil deshidrogenasa E3 FAD NAD+ Otras enzimas con igual mecanismo: Alfa-cetoglutarato DH, Alfa-cetobutirato DH, cadena ramificada cetoácido DH

Energéticamente muy favorable ( ΔG = -33.5 kJ/mol) y Piruvato Deshidrogenasa Fuente de acetil-CoA para el ciclo del ácido cítrico Cataliza la descarboxilación oxidativa del piruvato. Se usan 4 Vitaminas diferentes como coenzimas Piruvato + NAD+ + CoA-SH <-> Acetyl~CoA + NADH + CO2 Energéticamente muy favorable ( ΔG = -33.5 kJ/mol) y esencialmente irreversible in vivo. Todo el complejo puede inactivarse con compuestos con arsénico que se unen a sulfhidrilos (como en dihidrolipoamida) – Napoleón y Darwin -

Acetil-CoA Se origina en: Glucosa, ácidos grasos y aminoácidos. El enlace tioester posee una alta energía libre de hidrólisis Se origina en: Glucosa, ácidos grasos y aminoácidos. Es precursor de: ácidos grasos, colesterol, aminoácidos y se oxida en el Ciclo de KREBS Aporta los dos C que se van a oxidar en el ciclo del ácido cítrico. Acetil~CoA + H2O  acetato + HS-CoA + H+ ∆G°’ = -32,2 kJ/mol

ORIGEN DEL ACETIL~CoA - Descarboxilación del Piruvato ORIGEN DEL ACETIL~CoA - Descarboxilación del Piruvato. - Oxidación de Ácidos Grasos. - A partir de Aminoácidos cetogénicos.

Respiración aerobia y anaerobia

OTRO DESTINO DEL PIRUVATO Bicarbonato Piruvato OTRO DESTINO DEL PIRUVATO Piruvato Carboxilasa a

Estrategia General y objetivos del Ciclo del Acido Cítrico (C Estrategia General y objetivos del Ciclo del Acido Cítrico (C. de Krebs) En cada vuelta se introducen 2 carbonos (Acetil- CoA), y su equivalente será totalmente oxidado. Se liberan 2 moléculas de CO2. La energía libre de la oxidación se conserva en forma de coenzimas reducidas (NADH y FADH2) y GTP. Los intermediarios se reciclan y pueden dar AA, AG, Colesterol, Glc, Porfirinas, oxidar esqueletos de AA.

Ciclo de Krebs ó de los ácidos tricarboxílicos En el ciclo entra una molécula de acetato (dos átomos de C) salen dos moléculas de CO2 y cuatro pares de hidrógenos. 1 molécula de glucosa -> 2 de acetato (4 C), que se degrada en un proceso cíclico. Una serie de sustancias del ciclo ceden H por pares (2H) a otra (NAD, FAD) reduciéndola (a NADH, FADH2). En cierta forma, el proceso equivale a tener átomos de H que se pueden unir con el O durante la respiración para formar agua.

PIZARRÓN 3 - ICDH + NAD+: 4 - α-CETOGLUTARATO DH + NAD+: 1 - CITRATO SINTASA Adición de un grupo acetilo (transportado por HS-CoA) al Oxalacetato = Citrato 2 - ACONITASA Cambio de un grupo -OH del Citrato de la posición 3 a la 2, dando Isocitrato 3 - ICDH + NAD+: Deshidrogenación y descarboxilación. Oxidación del -OH del Isocitrato de la posición 2, debilitación y pérdida del -COO- central, dando Oxalosuccinato (alfa-cetoglutarato) 4 - α-CETOGLUTARATO DH + NAD+: Deshidrogenación , descarboxilación y síntesis (Similar a reacción de Piruvato-DH) Por la oxidación se debilita y pierde el –COO- . Ingresa 1 HS-CoA que transporta el Succinato, central, dando Oxalosuccinato (alfa-cetoglutarato) 5 - SUCCINIL-CoA SINTETASA: Hidrólisis del Succinil-CoA, c/liberación de suficiente E p/síntesis de GTP 6 - SUCCINATO DH + FAD+: Oxidación con insaturación del Succinato PIZARRÓN 7 - FUMARASA + H2O: Hidratación del Fumarato 8 - Malato DH + NAD+: Oxidación del Malato en su grupo alcohol (a carbonilo) reconstituyendo Oxalacetato.

[[Cis-Aconitato] EC 2.3.3.1. EC 4.2.1.3. EC 1.1.1.37. EC 1.1.1.41/42.

Moléculas: Simétrica Asimétricas (quiral)

C6H12O6 + 6O2=> 6CO2 + 6H2O G = -686 kcal/mol Glucosa + 2ATP + 4ADP + 2Pi + 2NAD+ 2 Ácido pirúvico + 2ADP + 4ATP + 2NADH + 2H+ + 2 H2O Balance 2 Piruvatos + 2 HS-CoA + 2 NAD + 2 Ácetil~S-CoA + 2CO2 + 2NADH + 2H+ + 180 g (1 mol) Glucosa son oxidados por 192 g (6 moles) de oxígeno y se forman 264 g (6 moles) de CO2 C6H12O6 + 6O2=> 6CO2 + 6H2O G = -686 kcal/mol

La metabolización de la Glc libera E que es capturada en moléculas de ATP (ó 30-32) 26

Se metaboliza tanta Glc requiera el Ciclo de Krebs La velocidad de la Glucólisis y la del Ciclo de Krebs (que consume Acetil-CoA) están integrados (bajo condiciones normales) por: Inhibición por altos niveles de ATP y NADH (componentes comunes de ambas vías); y Por la concentración de Citrato (producido en Krebs que inhibe la Fosfofructoquinasa 1 de la Glucólisis) Se metaboliza tanta Glc requiera el Ciclo de Krebs

Retiro de intermediarios hacia vías anabólicas Reposición anaplerótica de intermediarios agotados. Las reacciones de transaminación y desaminación de AA son reversibles, por lo que su dirección varía en función de la demanda metabólica.

Remoción de intermediarios puede saturarse. Tips del Ciclo de Krebs biosintético ahorro de energía Remoción de intermediarios puede saturarse. Única vía enzimática saturable azúcares ácidos grasos En la respiración aeróbica se conserva aprox. el 42 % de la energía de la glucosa en forma de ATP. 288 Kcal * mol-1 (1205 KJ* mol-1 ) Es una reacción fuertemente exergónica, con una energía libre ( G°) negativa. Se puede calcular el rendimiento de la siguiente forma: 288/ 686 x 100= 42 %. 29

TERMODINAMICA Y BIOENERGÉTICA Termodinámica: Campo de la física que describe y relaciona las propiedades físicas de la materia de los sistemas macroscópicos, así como sus intercambios energéticos. Sistemas macroscópicos: Conjunto de materia que se puede aislar espacialmente y que coexiste con un entorno infinito e imperturbable.

Bioenergética: leyes de la termodinámica -Estudia las transformaciones de energía que tienen lugar en la célula. -Naturaleza y función de los procesos químicos en los que se transforma la energía en seres vivos.

Necesitan de energía p/sus actividades CÉLULAS Necesitan de energía p/sus actividades (desarrollo, crecimiento, renovación de estructuras, síntesis de moléculas, etc). Según la fuente de carbonos: Autótrofos: Pueden utilizar el CO2 como fuente de C (bacterias, vegetales). Heterótrofos: obtienen C de moléculas orgánicas complejas (animales, microorganismos). CÉLULA ANIMAL Energía química para realizar trabajo proviene de la oxidación de sustancias incorporadas como alimentos (carbohidratos, grasas).

Metabolismo: “rutas metabólicas” Catabolismo: Anabolismo: Fase de suma de las reacciones químicas que ocurren en la célula (organizadas en series de reacciones catalizadas) = “rutas metabólicas” Fase de degradación Fase de síntesis ATP ADP NADPH+H+ NADP+ Catabolismo: Las moléculas nutrientes se convierten en otras mas pequeñas y simples. Anabolismo: moléculas pequeñas reaccionan para convertirse en otras más grandes y complejas.

En una transformación química, generalmente se rompen enlaces y el contenido de energía (E) de las moléculas aumenta o disminuye (DG aumenta o disminuye). “Moneda” de intercambio de Energía en los procesos biológicos = ATP

Beta-Oxidación y Krebs NADH, NADPH y FADH2 son los principales transportadores de electrones, ya que sufren oxidaciones y/o reducciones reversibles. Sus reducciones, permiten la conservación de la Energía Libre que se produce en la oxidación de los sustratos Ana l og í as Na t u r a l es

DEFINICIONES ENERGÍA: Es la “capacidad para producir un trabajo”. SISTEMA: “ toda porción del universo que se somete a estudio” Tipos de sistemas: Según el intercambio que se permita entre el sistema y el universo, éste puede ser:  Abiertos: intercambio de materia y energía.  Cerrados: intercambio de energía, no de materia.  Aislados: impide intercambio de energía y materia. MEDIO: “es lo que rodea al sistema” UNIVERSO = SISTEMA + MEDIO

DEFINICIONES Estado de un sistema: Se puede describir mediante propiedades medibles que se conocen como variables de estado. Algunos ejemplos de variables son: Temperatura Entropía (S) Presión Entalpía (H) Volumen

DEFINICIONES ENTALPÍA (DH): es la energía en forma de calor, liberada o consumida en un sistema a ,T y P constantes. ENTROPÍA (DS): energía no degradada, no utilizada para realizar trabajo. ENERGÍA LIBRE (DG): Representa la energía intercambiada en una reacción química. Es la energía disponible para realizar trabajo.

PRINCIPIOS DE LA TERMODINÁMICA PRIMER PRINCIPIO: “ LA ENERGÍA TOTAL DEL UNIVERSO PERMANECE CONSTANTE” Equivale a decir: la energía del universo no se crea ni se destruye, permanece invariante. Solo se transforma. SEGUNDO PRINCIPIO: “ LA ENTROPÍA DEL UNIVERSO AUMENTA” Equivale a decir que el grado de desorden en el universo aumenta.

Cambio de entalpía (ΔH) = calor de reacción Calor desprendido o consumido en el curso de una reacción.  Si se rompen los enlaces más débiles y se forman enlaces más fuertes se desprende calor, y la reacción es exotérmica (valor negativo de ΔH°).  Si se rompen enlaces fuertes y se forman enlaces más débiles, entonces se consume energía en la reacción, y ésta es endotérmica (valor positivo de ΔH°).

Entropía (S) Segundo principio: El desorden o entropía de un sistema aislado nunca puede decrecer.

Dirección de una reacción A una temperatura dada la espontaneidad de una reacción dependerá del balance entre dos tendencias, pudiendo determinarse relacionando las propiedades termodinámicas de entalpia (∆H) y entropía (∆S). ∆H = está en relación a la energía requerida para romper enlaces químicos (tendencia a formar los enlaces más fuertes posible). ∆S = está relacionado con el grado de dispersión de la materia y la energía (tendencia a dispersarse, al mayor desorden).

Dirección de una reacción De acuerdo a la termodinámica, la dirección preferencial para una reacción está determinada por el compromiso entre las tendencias hacia enlaces más fuertes (∆H) y mayor desorden (∆S). Se dice, entonces, que la diferencia entre ∆H y T∆S equivale a una cierta cantidad de energía útil para hacer trabajo, propiedad del sistema que se conoce comúnmente como energía libre de Gibbs (G).

Exergónica ó exotérmica Espontánea Reversible Una reacción química solo ocurrirá si ∆G°´ es negativo, es decir, si la energía libre del sistema disminuye (Reacciones exergónicas, que son espontáneas en la dirección escrita). G°´ disminuye (-∆G°´ ) G°´ disminuye (-∆G°´ ) Exergónica ó exotérmica Espontánea Reversible Las reacciones con ∆G°´ es positivo, donde la energía libre del sistema aumenta (Reacciones endergónicas o endotérmicas, no son espontáneas en la dirección en que se escriben) G°´ aumenta (+∆G°´ ) Endergónica ó endotérmica No espontánea Reversible

∆G°´ = -RT lnKeq La ecuación que relaciona ∆G y Keq es: R = 1.99 x 10-3 kcal/kelvin-mol T = temperatura absoluta en kelvins El valor de RT a 25°C es 0,593 kcal/mol

Keq de c/reacción química es característico a una Tº dada. EQUILIBRIO QUÍMICO Keq = [C][D] / [A][B] Keq de c/reacción química es característico a una Tº dada. Si Keq >1, la reacción está desplazada hacia (1) Si Keq <1, la reacción está desplazada hacia (2) Si Keq =1, la reacción está en Equilibrio (no hay desplazamiento neto). En seres vivos las reacciones se desplazan del equilibrio.

CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE EN LAS REACCIONES QUÍMICAS Fundamentalmente sólo hay dos razones por la que ocurre una reacción química: (1) la tendencia a lograr el mínimo de energía (2) la tendencia a lograr el máximo desorden Medir el contenido de energía de un sistema es muy difícil, generalmente se mide el cambio de energía entre dos estados. La variación de energía (DG) para ir de A hacia B es: DGBA = GB - GA Para ir de B hacia A: DGAB = GA – GB = - DGBA

CAMBIOS DE ENERGÍA LIBRE EN LAS REACCIONES QUÍMICAS Matemáticamente: DG = DH -TDS DGº es la variación de Energía Libre en condiciones estándar (Tº= 298ºK,[1M],P = 1atm) DGº’ es la variación de energía libre estándar a un pH próximo al fisiológico (pH = 7) R = 1,987 cal/mol grado

PROCESO EXOTÉRMICO: es aquel que transcurre con liberación de calor al medio. PROCESO ENDOTÉRMICO: el que transcurre tomando calor del medio. PROCESO EXERGÓNICO: libera energía. (ESPONTANEO) PROCESO ENDERGÓNICO: absorbe energía. (NO ESPONTANEO)

E libre ó E de Gibbs (G) G = Gfinal – Ginicial Función más importante en Bioquímica Proceso real o factible = cambio de E libre de Gibbs negativo (-G) G = Gfinal – Ginicial G < 0 (FACTIBLE y EXERGÓNICO) G = 0 (ISOERGÓNICO-en equilibrio) G > 0 (NO FACTIBLE y ENDERGÓNICO) REACCIONES CON: -G = son exergónicas y espontáneas a derecha +G = endergónicas e inviables a derecha – pero pueden ser viables por acoplamiento energético con las exergónicas

VIDEO 2 http://www.youtube.com/watch?v=KcsNFNjjD5c

COMPUESTOS DE ALTA ENERGÍA Compuestos c/Patos ∆G° de hidrólisis, en kJ/mol Fosfoenolpiruvato (-61.9) 1,3-bifosfoglicerato (-49.3) Fosfocreatina (-43.0) ATP (-30.5) ADP Glucosa-1-fosfáto (-20.9) Glucosa-6-fosfáto (-13.8)

-61,9 kJ/mol (-14,8 cal/mol) -51,4 kJ/mol (-12,3 cal/mol) -43,1 kJ/mol (-10,3 cal/mol) -30,5 kJ/mol (-7,3 cal/mol) -13,8 kJ/mol (-3,3 cal/mol) -9,2 kJ/mol (-2,2 cal/mol)

ENZIMAS PRESENTES EN CASI TODAS LAS CÉLULAS ATP a pH fisiológico está como ATP4-. 4 cargas (-) próximas originan tensiones intramoleculares que desaparecen al hidrolizarse en ADP+Pi o AMP+PPi. Mg++ ENZIMAS PRESENTES EN CASI TODAS LAS CÉLULAS Mg++

Transferencia de energía en el metabolismo celular P (grupos fosfato) = conservación y transferencia de E 1,3-Bis-P-Glicerato y 2P-PEP ceden E al ADP->ATP Creatín-P y Arginín-P = reservas de E p/cederla al ATP (en tejidos con mayores requerimientos temporales como el músculo) Fosforilación oxidativa: transforma ADP en ATP (c/E liberada por oxidación de coenzimas reducidas)

Reacciones acopladas Las Enzimas pueden combinar reacciones exergónicas con endergónicas para resultar en una reacción acoplada que en conjunto es exergónica (reacción espontánea).

REACCIONES ENERGÉTICAMENTE ACOPLADAS Una reacción altamente exergónica puede hacer que otra endergónica ocurra si ambas se acoplan. nombre DGº’(kcal/mol) ATP ADP + P -7,3 ADP AMP + P -7,7 AMP adenosina + P -3,4

GLUCOSA + ATP  GLUCOSA-6-P + ADP ∆G°’ = -7,3 + 3,3 = -4,0 Kcal/mol “Los valores de DGº de reacciones secuenciales son aditivos” Este principio explica por que una reacción termodinámicamente desfavorable puede ocurrir, si se acopla a otra reacción que sea exergónica, a través de un intermediario común GLUCOSA + ATP  GLUCOSA-6-P + ADP ∆G°’ = -7,3 + 3,3 = -4,0 Kcal/mol

ACTIVACION Es la unión de moléculas biológicas de modo tal que, la ruptura de ese enlace químico formado, tiene un DG <0 Ejs: 1) A + COENZIMA A-COENZIMA A-COENZIMA + B AB + COENZIMA DG<0 2) FOSFORILACION

Estructura química de la Acetil CoA Estructura química de la Acetil CoA. El grupo acetilo aparece a la izquierda de la figura, unido al azufre (S) ADENOSINA ÁCIDO PANTOTÉNICO CISTEÍNA

La Coenzima A es un transportador de grupos acilo. Al grupo sulfhidrilo terminal, se unen los grupos acilo mediante un enlace tioester. La hidrólisis de un tioester es muy favorable termodinámicamente, lo que hace que esta molécula tenga un alto potencial de transferencia de grupos acilo. La CoA es un “transportador de acilos activado” igual que el ATP es “un transportador de P activado”.