MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE RAQUIS DE PALMA Juan Fernando Arenas B. Mariana Peñuela Vásquez, PhD Tutora MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE RAQUIS DE PALMA Grupo de Bioprocesos Facultad de Ingenieria Universidad de Antioquia

Contenido Introducción Aspectos Teóricos Objetivos Materiales y métodos Resultados Conclusiones

Planteamiento del Problema Materiales Lignocelulósicos Ventajas Desventajas Fácil acceso Bajo costo Mitigación de impactos ambientales Integración de procesos Madurez de las tecnologías para desarrollar pretratamientos Costo de producción de enzimas Diferencia de condiciones entre las enzimas y las levaduras La termotolerancia es un importante topico a desarrollar en la tecnologia SSF. Las temperaturas optimas para las enzimas (~ 50C) y los MO (~ 30 - 37). Los esfuerzos para acercar estos rangos de operación favorecen el rendimiento del proceso.

SSF: Sacarificación y fermentación Simultáneas Aspectos Teóricos SSF: Sacarificación y fermentación Simultáneas Glucosa La celulosa presente en el material vegetal es atacado por las celulasas, las cuales progresivamente degradan la cadena polimerica liberando celobiosa, dextrinas y finalmente glucosa, las cual es aprovechable por las levaduras para producir el etanol. Los requerimientos generales para que un MO pueda ser usado en la produccion de etanol son: alta productividad de etanol y alta resistencia a concentraciones elevadas de etanol. Capacidad para utilizar tanto hexosas como pentosas. La mayor desventaja de las celulasas es su costo, pero en los ultimos a~nos su costo se ha reducido a la mitad y su actividad ha aumentado. Siempre es deseable la minima adicion de enzima. S. Cerevisiae Celulosa Etanol Celulasas

SSF: factores involucrados Sustrato Pretratamiento Enzima Levadura Carga de sustrato: se busca lograr altas concentraciones de sustrato, teniendo en cuenta las limitaciones de agitacion Tiempo de prehidrolisis: es deseable alcanzar una concentracion que sustente el proceso fermentativo, aunque se aumenta el tiempo de proceso Carga enzimatica: variable muy sensible por los costos, se debe ajustar para cada tipo de sustrato Concentracion del microorganismo: tiene influencia sobre el tiempo de proceso y costos de la generacion de la biomasa. El valor tipico ronda los 2g/L Temperatura

Aspectos teóricos – el estrés celular El estrés celular es una respuesta metabólica de los organismos para interactuar con un conjunto de condiciones externas que afectan su funcionamiento, activando un mecanismo de defensa que permita sobrevivir al estado de estrés o disparando la fase de muerte celular para que eventualmente se eliminen las células dañadas en el proceso (Fulda, Gorman, Hori, & Samali, 2010)

Aspectos teóricos – el estrés celular El estrés de las levaduras se manifiesta por la síntesis de proteínas de shock (HSP: heat shock proteins), incremento de los niveles de trehalosa y glicerol, alteraciones de la composición de la membrana lipídica, entre otras. El estrés térmico y osmótico producen reacciones similares a nivel celular.

360 Proteínas estructurales ZINC Estructural Cofactor Catalítico 360 Proteínas estructurales Enzimas glicolíticas Plegamiento de proteínas Zn: el mas estudiado, efecto sobre biomasa y viabilidad Ca: sin efecto significativo Mg: efecto sobre biomasa Fe: efecto negativo sobre biomasa y viabilidad Co: efecto sobre la productividad

Funciones del zinc en el metabolismo celular (Zhao, 2011)

Objetivos El propósito del trabajo y como afrontar los retos…

Objetivo General Estudiar algunos de los factores de mayor influencia en la producción de etanol, mediante sacarificación y fermentación simultánea de la fracción celulósica del raquis de palma africana, empleando la levaduras S. cerevisiae.

Objetivos Específicos Determinar la influencia de la suplementación de los medios de cultivo con Zn2+ sobre la termotolerancia y osmoresistencia de las levaduras objeto de estudio. Evaluar el efecto de la temperatura, el pH, la concentración de sólidos y la carga enzimática en la hidrólisis enzimática, así como la influencia de sus interacciones sobre el proceso. Analizar el desempeño de la levadura en los sistemas SSF para la producción de etanol. Establecer las condiciones operacionales del sistema SSF para optimizar la producción de etanol, considerando las características de termotolerancia y osmoresistencia de la levadura.

Materiales y Métodos

El Sustrato Planta de extracción de aceites “Manantiales” Fermentaciones Industriales UNAL Bioprocesos Tratamiento ácido

La Levadura La enzima Componente Concentración [g/l] Glucosa 20 Peptona 5 Extracto de levadura 3 Agar – Agar La enzima

Métodos analíticos Parámetro Método Actividad enzimática Ghose (1987) modificado por Vásquez (2007) Biomasa Peso seco vs absorbancia Azúcares ATR por DNS Glucosa por glucosa oxidasa Etanol Peso equivalente Cromatografía gaseosa

Desarrollo Experimental Zinc Etanol Temperatura Viabilidad Crecimiento Resultados no concluyentes

Desarrollo Experimental S. cerevisiae bajo condiciones de estrés [EtOH] = 20 g/L, T =  40°C. E5: Concentración de Zn2+=0.01g/L, E7: Concentración de Zn2+=0.1g/L, B2: blanco Disminucion marcada de la produccion de biomasa y baja viabilidad celular sin importar el nivel de suplementacion. Exclusion del etanol como factor de estudio, pues las concentraciones posibles estaban lejos de los niveles maximos reportados para las levaduras (120g/L para red y 20 para kluy) Limitacion del rango de temperaturas estudiado, el original era 50C y termino siendo muy ambicioso Abandonar el metodo de viabilidad celular, pues no resultaba acertado El efecto del zin fue notorio, por presencia o ausencia Rediseño de los medios de cultivo Replanteamiento del esquema experimental

Desarrollo Experimental - Medio Modificado Componente Concentración [g/l] Glucosa 20 Peptona 5 Extracto de levadura 3 Urea 2.059 Medio modificado para S. cerevisiae

Desarrollo Experimental Influencia del zinc sobre el crecimiento a diferentes temperaturas Estudio del raquis como sustrato para los procesos SSF

Desarrollo experimental - Estudio del raquis como sustrato para los procesos SSF Caracterización Definición del pretratamiento Cinética de hidrólisis Inoculo Línea de base Evaluación de la suplementación Validación

Concentración Zn2+ [g/L] Influencia del zinc sobre el crecimiento a diferentes temperaturas – Matriz experimental Concentración Zn2+ [g/L] Temperatura [°C] 0.01 37 0.1 45 50 S. cerevisiae

37 °C 37 °C El zinc tiene efecto especialmente en la fase de latencia Para la menor temperatura el ion tiene un efecto toxico sobre la levadura Para la temperatura media se observa un incremento en la cantidad de biomasa para la curva suplementada Para la mayor temperatura la combinacion temperatura – ion es aun mas toxica, se comporta mejor el blanco. El decrecimiento en los valores de biomasa se explica por la formacion de cumulos de biomasa. La temperatura limite de estudio sera entonces 45C, pues hasta ahí se observo un buen comportamiento del MO Influencia del zinc sobre el crecimiento a diferentes temperaturas – S. cerevisiae 50 °C

Evaluaciones con material lignocelulósico Raquis de palma

Desarrollo experimental – Cinética de hidrólisis En esta etapa se presenta una desaceleración notable en la velocidad de producción de glucosa, causada por la cristalinidad de la celulosa proveniente del raquis de palma. Se ha probado que la actividad de las celobiohidrolasas (CBH) juega un papel fundamental en la hidrólisis de la celulosa, así como el sinergismo existente con las endoglucanasas (EG). En presencia de materiales con alto contenido de celulosa cristalina la velocidad de absorción de las CBH sobre el sustrato es reducido, afectando a la vez el sinergismo con las EG, este fenómeno tiene como resultado final la desaceleración de la rata global de hidrólisis (Wang et al., 2006)

Desarrollo experimental – Cinética de hidrólisis Factor Rango Respuesta Significativo Optimo S/L [g/mL] 10 -20 Glucosa [g/mL] SI 15 Carga [FPU/g] 10-30 16.73 Arreglo experimental 32 con tres repeticiones del punto central Factor mas influyente: relacion S/L… se debe tener en cuenta el grado de agitacion posible El modelo obtenido en el software Design Expert muestra valores de ajuste son R2 = 0.9561 y de R2 (adj)= 0.9194 El valor de carga se traduce en ahorros para el proceso. El valor de carga puede explicarse debido a que en el caso del raquis de palma el sustrato mismo es el componente limitante de la hidrólisis y no la cantidad de enzima Se minimizo la carga

Desarrollo experimental – Cinética de hidrólisis Nótese claramente que para el momento definido de la etapa de prehidrólisis, es decir la hora 37, la concentración de ATR es de tan solo 38 g/L. Probablemente esta sea la razón para que la producción de etanol a partir de raquis sea tan lenta, pues debe recordarse que cuando se da inicio al proceso SSF como tal es necesario reducir la temperatura desde 50°C hasta 37°C, haciendo aun más lenta la etapa de hidrólisis y reduciendo por tanto la concentración de sustrato disponible para los microorganismos. Cinética de hidrólisis enzimática para el raquis de palma para condiciones optimizadas. Enzima: Acellerase 1500, Carga: 16.73FPU/g Buffer citrato pH 4.8 Temperatura = 50°C

Desarrollo experimental – Determinación del inoculo 2 g/L Cinéticas de producción de etanol a partir de EFB para diferentes concentraciones de inóculo de S. cerevisiae Ethanol Red. Concentraciones de levadura: E1, E2 = 2 g/L; E3 = 3 g/L; E4 = 5 g/L; E5, E6 = 6 g/L; E7 = 4 g/L.

Estudios de suplementación sobre sistemas SSF empleando raquis

Desarrollo experimental-Determinación de la línea base Microorganismo Concentración de etanol Promedio [g/L] S. cerevisiae 16.65 Cinética de producción de etanol usando raquis como sustrato en sistema SSF con S. Cerevisiae Condiciones mejoradas: Pretratamiento alcalino termopresurizado S/L 1:15 Carga enzimática 16.73 FPU/g Tiempo de prehidrólisis 36 horas

37 °C 41°C Para T = 37C, no hay diferencia en la suplementacion El aumento de temperatura disminuye la produccion de etanol, notandose un efecto protector para el nivel bajo de suplementacion Para el nivel mas alto de temperatura se presenta un efecto de mayor toxicidad por la presencia del ion, pero la produccion decae en todos los casos 45°C Influencia del zinc sobre la producción de etanol a diferentes temperaturas – S. cerevisiae

Evaluación de la suplementación – S. cerevisiae Factor Rango Respuesta Significativo Optimo Zinc [g/L] 0.01 – 0.1 Etanol SI 0.017 Temperatura [°C] 37 - 45 37 Arreglo experimental 32 con tres repeticiones del punto central

Blanco --- 37 16.65 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 Influencia del zinc sobre la producción de etanol a diferentes temperaturas – S. cerevisiae Unidad Experimental Zn [g/L] Temperatura [°C] Concentración de etanol real [g/L] Blanco --- 37 16.65 E1 0.01 32.3 E2 0.055 31.9 E3 0.1 30.9 E4 41 1.7 E5 2.5 E6 E7 45 1.8 E8 E9 1.3 E10 1.9 E11 2.1 E12 E13 2.2 Con la suplementacion es posible alcanzar concentraciones mas altas de etanol con referencia al blanco

Validación de Resultados S. cerevisiae (Ethanol Red) Concentración del inóculo [g/L] 2 Tipo de inóculo Liofilizado directo Masa sustrato [g] 17.6 Relación S/L 15 Enzima Acellerase 1500 Carga enzimática [FPU/g] 16.73 Tiempo de prehidrólisis [h] 36 Temperatura para hidrólisis [°C] 50 Tiempo de fermentación [h] 72.5 Temperatura para fermentación [°C] 37 Medio para fermentación Buffer citrato pH 4.8 Concentración ZnSO4 [g/L] para suplementación 0.017 Velocidad de agitación [rpm] 200 Modo de operación Anaerobio con trampa de gas

Validación de Resultados – S. cerevisiae La fase de adaptacion sigue siendo muy larga, pero menor comparada con los primeros ensayos La fermentacion no deberia llevarse mas alla de las 60 horas pues empieza a degradar el etanol Se refuerza el hecho de que la suplementación con zinc permite alcanzar concentraciones mayores de etanol, debido a su importancia en la síntesis de las enzimas glicolíticas imprescindibles en la asimilación de los carbohidratos Al final del proceso la hidrólisis decae casi totalmente Etanol predicho = 32.14 g/L, diferente del real = 23.96 g/L… a pesar del ajuste del modelo. Puede deberse a la variabilidad del material o a la desactivacion de la enzima.

g Etanol / g biomasa tratada Rendimientos g Etanol / g biomasa tratada Ensayo inicial 0.087 Línea base 0.096 Suplementado 0.127 Blanco 0.118

Conclusiones Temperatura de trabajo y suplementación con ZnSO4 Realmente no se logró un aumento en la temperatura de operación, pero la suplementación permitió una mejora global en la producción de etanol .

Conclusiones Relación sólido – líquido (S/L) La realización de los procesos SSF a altas relaciones sólido – líquido favorece su rendimiento global pues se alcanzan mayores concentraciones de azúcares. Se incremento la relación de 10 a 15 para el raquis, empleando un criterio operacional

Conclusiones Tiempo de prehidrólisis Fue necesario triplicar el tiempo de hidrólisis para aumentar la producción de etanol. Este aspecto debe mejorarse pues los costos asociados reducen la competitividad del proceso. La naturaleza del sustrato es el aspecto más limitante del proceso

Conclusiones Carga enzimática Se logró una disminución del 44% en el consumo de enzima Comparativamente con otros materiales el raquis de palma requiere menos enzima para su hidrólisis, precisamente por ser la etapa limitante del proceso.

Conclusiones Concentración del inóculo Tiempo de fermentación Se fijó en el valor mínimo de 2g/L, esto se traduce en ahorro en la cantidad de biomasa necesaria Tiempo de fermentación Es el aspecto más problemático del proceso, pues resultó ser muy prolongado. Tiene componentes tanto de la fase de adaptación como de la velocidad de hidrólisis del material.

Conclusiones – Comparación con estudios similares Concentración [g/L] Productividad [g/L*h] Referencia S. cerevisiae Fibra de palma 12.1 1.01 (Boonsawang, 2012) Troncos de palma 13.3 0.14 (Jung et al., 2011b) Raquis de palma 52.0 0.32 (Tan et al., 2013) Raquis de palma (continuo) 48.54 0.61 (Han & Kim, 2011) 22.3 0.38 Este estudio

MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE RAQUIS DE PALMA Juan Fernando Arenas B. Grupo de Bioprocesos Universidad de Antioquia juan9188@gmail.com MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE RAQUIS DE PALMA