Aspectos a tener en cuenta en el análisis de residuos de plaguicidas en vegetales por LC/MS/MS F. Mocholí Seminarios ABI, Noviembre 2007

Tiempos Pasados Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos muy limpios Evitar contaminación cromatográfica Mantener el sistema inerte Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de Fluorescencia) Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC) Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir mejoras

Tiempos pasados Smash the vegetable sample (50g) Homogeneize (20sec) Filter SPE/GPC Evaporate +60ml EtOAc + 13g Na2SO4 Reconstitute with 5ml Cyclohexane 10 fold concentration

Tiempos pasados Distintas técnicas para distintos compuestos (UV, derivatización para Fluorescencia, etc.) Pobre selectividad (longitud de onda, espectro UV) Baja sensibilidad Limitado número de compuestos Duración de los cromatogramas DAD, 2mg/Kg standard

GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular Ionic Analyte Polarity Molecular Weight 10 1 2 3 4 5 Non-Ionic LC/MS Ionspray GC/MS

Evolución de LC/MS Necesidad de confirmación por MS Número de analitos en aumento Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez) Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto, presión, etc.) La ionización en LC/MS solo da 1 ion MS/MS Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.) Identificación de desconocidos

Ionización por Electrospray

Ion Spray (ESI)

Ion Spray (ESI)

Ion Spray (ESI)

Ion Spray (ESI)

Fuentes de ionización para ESI Electrospray hasta 1 ml/min Dependiente de la Concentración Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente) Flujos de líquido 5-200 ul/min Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente) Flujos de líquido 5-1000 ul/min Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases) Flujos de líquido 5-2000 ul/min Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos

Estrategias para mejorar la robustez Problema: Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco volátiles Solución: Hacer que los iones describan un camino má o menos tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez) Off axis Pepperpot Orthogonal Crossflow LCZ aQa

Estrategias para mejorar la robustez OSA Angle N2 TurboIonSpray® Turbo V source®

ESI: Mecanismo supresión iónica Supresión Iónica  Reducción señal Analito Pares iónicos Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la evaporación de los iones) Efectos competitivos durante la evaporación de los iones Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc. compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas.

Supresión señal iónica Menos señal a mayor concentración del tampón

Comparación matrices Vegetales full scan Lechuga Naranja Uva

Efecto Matriz Lechuga 0.010mg/Kg Uva 0.010 mg/Kg Columna 15 cm

Q1 Q2 Q3 SIS CID FULL SCAN MS/MS Fuente Ioniz. Fuente Ioniz. First the triple quad sytem on the top. Ions are formed in the ion source of the instrument and drawn immediately through Q1 (Quad #1). This is the isolation step, The first quadrupole only allows one particular m/z ratio to be passed through to the next quadrupole. In Q2, ions are accelerated and collide with a collision gas such as argon which is added separately in this stage. The collision energy is adjusted until characteristic product ions are produced. The product ion spectrum is the collected by scanning Q3 to collect the mass spectrum. All of this looks very nice and logical, but you are probably concerned that there are three quadrupole analyzers involved, and a lot of lenses which need to be tuned to focus ions through the system. It is neither inexpensive nor simple. The triple-quadrupole approach is referred to as Tandem-in-Space because each of the MS/MS steps is accomplished at a different location. The ion trap approach is called Tandem-in-Time, because we are performing each step in the same place, but at a different time. This means we only need one ion trap to do MS/MS! As we discussed at the beginning of the talk, the first step is ionization and storage of ions. In MS/MS we now apply a waveform to the endcap electrodes to eject all ions except the parent ion of interest. Next, we apply another waveform to increase the collision energy and dissociate the parent ions to product ions. Finally, we scan the product ions to the multiuplier and collect the mass spectrum. Notice that all of this additional capability is “just software”! Fuente Ioniz.

¿Qué “Dwell time” debo utilizar? 1 transición MRM (1 compuesto) 30 segundos X Como media, se requieren 15 puntos (o al menos 10) para integrar con precisión un pico cromatográfico (Anchura del pico)/(número de puntos)= 30/15 = 2 segundos Se necesita 1 punto cada 2 segundos (2000 ms)

¿Qué “Dwell time” debo utilizar ¿Qué “Dwell time” debo utilizar? 2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual) Si “dwell time” permanece constante; el tiempo para cada compuesto es 2000 ms: 2000 ms + 2000 ms ----------- 2 compuestos: 4000 ms 30 segundos X 30 segundos / 4000 ms = 7.5 puntos sólo!

En una columna de 2mm id, 3mm la anchura de pico es ¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente? Anchura de pico 30 s “Dwell time” constante => El número de puntos para definir el pico cae rápidamente Time MRM Puntos 2000 1 15 2000 2 7 2000 3 5 Número de puntos por pico constante => “Dwell time” debe disnimuir! Dwell time (ms) MRM Puntos 3DTrap QqQ 2000 1 15 Sí Sí 1000 2 15 Sí Sí 667 3 15 Sí Sí 200 10 15 Sí/No Sí 100 20 15 No Sí 10 200 15 No Sí En una columna de 2mm id, 3mm la anchura de pico es normalmente 10 s, así que se debe dividir todo por 3

A medida que disminuye el d.i. o el tamaño de partícula de la columna, ¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente? Anchura de pico 10 s Para 10 puntos por pico cromatográfico => “Dwell time” debe disminuir! Dwell time (ms) MRM Data points 3DTrap QqQ 1000 1 10 Sí Sí 500 2 10 Sí Sí 333 3 10 Sí Sí 100 10 10 Sí/No Sï 50 20 10 No Sí 10 100 10 No Sí 5 200 10 No Sí A medida que disminuye el d.i. o el tamaño de partícula de la columna, la anchura de pico también disminuye, pero para mantener el número de puntos, debe disminuir el “Dwell time”

Prueba Columnas LC/MS. Analitos Acephate Demeton-S-methyl sulfoxide Imazalil Omethoate Acetamiprid Dichlorvos Imidacloprid Oxamyl Aldicarb Diflubenzuron Indoxacarb Picoxystrobin Aldicarb Sulfone Dimetomorph Linuron Propoxur Aldicarb Sulfoxid Diuron Lufenuron Pyraclostrobin Benfuracarb Ethiofencarb sulfone Methamidophos Spiroxamine Carbendazim Ethiofencarb sulfoxide Methiocarb Tebufenocide Carbofuran Fenhexamid Methiocarb sulfone Thiametoxam Carbofuran 3OH Fludioxonil Methiocarb sulfoxide Thicloprid Carbosulfan Flufenoxuron Methomyl Trifloxystrobin Clofentezine Hexaflumuron Monocrotophos Total analytes, 43

Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes Columnas Probadas Atlantis T-3 (Waters), 100 mm, 2.1 mm, 3mm Hypersil Gold (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm Hypersil Gold aQ (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm QS Strategy 3RP (Interchim), 100 mm, 2.0 mm, 3mm Polaris C18 A (Varian), 100 mm, 2.0 mm, 3mm Ascentis RP-Amide (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 3mm Ascentis Express C18 (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 2.7mm Sinergy Hydro (Phenomenex), 100 mm, 2.0 mm, 2.5mm Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes

LC/MS Columns Linearity Test Número de compuestos con r2>0.99 6 diferentes concentraciones desde 0.001 a 0.200 mg/Kg, 3 replicas por concentración (18 inyecciones).

Prueba de anchura de pico LC/MS Anchura de pico (anchura a mitad de altura) en segundos Leyenda: Muy Ancho Ancho Bueno Estrecho (muy bueno) Todos los cromatogramas tienen la misma achura (2 min)

Prueba de anchura de pico en columnas LC/MS RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8 2.72 Methamidophos 27 37 18 16 28 24 20 4.77 Acephate 25 35 15 33 30 38 17 5.24 Omethoate 26 9 5.46 Aldicarb Sulfoxid 12 10 13 5.65 Aldicarb Sulfone 5.74 Oxamyl 5.87 Carbendazim 5.92 Demeton-S-methyl sulfoxide 6.01 Methomyl 6.11 Thiametoxam 6.29 Monocrotophos 6.61 Ethiofencarb sulfone 6.72 Imidacloprid 6.73 Ethiofencarb sulfoxide 6.94 Methiocarb sulfoxide 7.16 Carbofuran 3OH 7.20 Acetamiprid 7.37 Methiocarb sulfone 7.65 Thicloprid 8.13 Aldicarb 8.73 Dichlorvos 8.77 Imazalil

LC/MS Columns Peak Width Test RT Analyte 1 2 3 4 5 6 7 8 8.85 Propoxur 8.90 Carbofuran 9 9.58 Spiroxamine 11 22 20 9.95 Diuron 10.40 Linuron 10.50 Methiocarb 10.60 Dimetomorph 16 18 23 21 Fludioxonil 12 11.00 Fenhexamid 11.20 Diflubenzuron Picoxystrobin 11.30 Tebufenocide 11.60 Pyraclostrobin 11.70 Clofentezine 10 11.80 Indoxacarb 11.90 Trifloxystrobin 12.00 Hexaflumuron 12.20 Benfuracarb 12.30 Lufenuron 12.50 Flufenoxuron 13.00 Carbosulfan

Methamidophos 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

Acephate 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

Omethoate 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

Oxamyl 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

+Hexaflumuron 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

Trap 3D Q TRAP QqQ Tecnologías MS Sensibilidad Full Scan MS3 (o más) Sensibilidad MRM Pérdida de Neutros Barrido de Precursores Sensibilidad Full Scan MS3 Sensibilidad MRM Pérdida de Neutros Barrido de Precursores The Q Trap combines the best features of a traditional 3-D trap and a triple quad into one instrument.

Adquisición Dependiente de la Información (IDA) Búsqueda de desconocidos Barrido de MRM Barrido en “Multiple Reaction Monitoring” de cientos de compuestos (solamente 1 transición por analito...) Criterio IDA (umbral...) Adquisición automática de espectros en modo “Enhanced Product Ion Scans” en la trampa Sustracción de Fondo Dinámica y Exclusión Dinámica Búsqueda en bibliotecas de espectros Umbral de señal Exclusión Dinámica Scans dependientes

Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil) Metalaxil en uva Library CE=20V CE=20V Fit 0.956 RFit 0.956 Purity 0.955 Library CE=35V CE=35V Fit 0.953 RFit 0.955 Purity 0.951 Library CE=50V CE=50V Fit 0.735 RFit 0.618 Purity 0.607 Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil)

Y la historia continua... Conclusiones A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo: Una disminución increíble en los límites de detección Aumento en el número de compuestos en un único análisis Gran Selectividad Preparación de la muestra más sencilla Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un laboratorio de plaguicidas. Y la historia continua...