Desde la genética básica a la secuenciación masiva en cáncer hereditario Dr. José Luís Soto Martínez Hospital General Universitario de Elche Madrid 26 Septiembre 2018

Disclosure Information Employment: Consellería de Sanitat. Generalitat Valenciana Consultant or Advisory Role: NO Stock Ownership: NO Research Funding: NO Speaking: NO Grant support: NO Other: Author have no conflict of interest to declare

NGS Evolución tecnológica Mejora conocimiento Limitaciones de la secuenciación masiva Nuevos escenarios NGS Variantes genéticas de significado clínico desconocido Nuevas perspectivas Herramientas en la web

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El genoma humano. Hitos históricos National Human Genome Research Institute (NHGRI) from Bethesda, MD, USA

Lu JT et al. N Engl J Med 2014;371:593-596 Next Generation Sequencing. NGS Lu JT et al. N Engl J Med 2014;371:593-596

¿Cuántos genes tiene el genoma humano? 23 pares de cromosomas https://www.gencodegenes.org 3,3·109 bp

NGS nuevo escenario. Distribución de costes de análisis y gestión de datos

Diferentes dimensiones de secuenciación 1 gene 2-5.000 genes 48 x 106 nt 20.000 genes 3.200 x 106 nt Single gene testing Gene panels Whole Exome Sequencing Whole Genome Inherited / germline vs. Acquired / somatic Disease specific vs. General genomic medicine WGS WES

Máximo rendimiento de secuenciación entre diferentes plataformas 1 Gb 7,3 h Ion PGM GeneStudio S5 25 Gb 12 h (5) # WES 100X - MiSeq2 NextSeq550 NovaSeq Platforms 15 Gb (3) 39 Gb 12 26 h 56 h 3000 Gb 625 45 h

Síndromes de predisposición hereditaria a cáncer Fenotipo clínico

Heterogeneidad genética y pleiotropismo en cáncer hereditario

Riesgo acumulado a cáncer colorrectal gen-específico Genotype-led phenotype discovery? Promiscuous genotype-phenotype correlations

17 2 6 19 25 17 12 26 15 17 18

NGS dx ¿Más es mejor? PROS Mayor número de VOUS CONS Más conocimiento científico No incremento significativo de costes PROS Más rendimiento diagnóstico Mayor número de VOUS CONS Más hallazgos inesperados Más incertidumbre

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20.000 hereditary-cancer NGS panels 47 genes Sanger Confirmation Is Required to Achieve Optimal Sensitivity and Specificity in Next-Generation Sequencing Panel Testing. Mu W, Lu HM, Chen J, Li S, Elliott AM. J Mol Diagn. 2016 Nov;18(6):923-932. 20.000 hereditary-cancer NGS panels 47 genes 98.7% were concordant between NGS and Sanger 1.3% false positives (A/T-rich regions, G/C-rich regions, homopolymer stretches, repetitive sequences and pseudogene regions) Simulating a false-positive rate of zero by adjusting the variant-calling quality-score thresholds decreased the sensitivity of the assay from 100% to 97.8% resulting in the missed detection of 176 Sanger-confirmed variants [2,2% false negatives] CONCLUSION: Sanger confirmation of NGS variants is needed to maintain the highest possible sensitivity

Mutationes en secuencias próximas a homopolímeros Exon 1 7 2 3 4 5 6 MSH2-Exon 5 skipping c.942+2T>A c.942+3T>A Analytical challenges in the genetic diagnosis of Lynch syndrome – difficult detection of germ-line mutations in sequences surrounding homopolymers Castillejo M.I., Castillejo A., Barbera V.M., Soto J.L. eJIFCC2016Vol27No1pp077-083 Gene DNA change Protein change InSiGHT class # families CV (% of MSH2) # families InSiGHT MSH2 c.942+2T>A p.(Val265_Gln314del) 5 4 4/3055 (0,1%) c.942+3T>A 215/3055 (7%)

518 individuals from PROMPT cohort (603 variants) Conflicting Interpretation of Genetic Variants and Cancer Risk by Commercial Laboratories as Assessed by the Prospective Registry of Multiplex Testing. Balmaña J, et al. J Clin Oncol. 2016 Dec;34(34):4071-4078 518 individuals from PROMPT cohort (603 variants) 56/518 (11%) conflicting interpretations: pathogenic/likely pathogenic to VUS, a discrepancy that may alter medical management CONCLUSION: Conflicting interpretation of genetic findings from multiplex panel testing used in clinical practice is frequent and may have implications for medical management decisions.

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Interpretations od genomic sequencing: variants should be considered uncertain until proven guilty Weck KE. Genet Med. 2018 Mar;20(3):291-293. Peligros potenciales de la “sobreclasificación” de variantes genéticas como patogénicas: Un diagnóstico genético incorrecto en un individuo puede privar de futuros estudios para un correcto diagnóstico y/o un tratamiento ineficaz del paciente. Realizar estudios a familiares a riesgo con resultados espurios, que pueden conducir a cribados o actuaciones inapropiados. Tomar decisiones reproductivas basadas en información incorrecta. Clasificaciones erróneas de las variantes en la literatura y/o bases de datos pueden afectar a la interpretación de los resultados de futuros pacientes

VUS: opiniones/declaraciones Antes creía que uno podía tener un gen mutado o no, y con todos los antecedentes de cáncer en mi familia, estaba convencido que yo tenía una mutación. No sabía que había una enorme tercera categoría. No obtuve información útil. Me sentí como que había desperdiciado mi sangre para obtener un interrogante gigante (paciente). Hay mucha incertidumbre. La gente piensa que los test genéticos son algo parecido a los test de embarazo, o estas embarazada o no lo estas. Sin embargo, son más parecidos a una predicción del tiempo, y la mayoría de la gente no está preparada para hacer frente a las probabilidades e incertidumbres que conlleva (Robert Klitzman, bioeticista). Cuando se estudian las mutaciones con un panel de genes por NGS está prácticamente garantizado que se va a encontrar al menos una VUS. Cuantos más genes se estudien, más VUS se van a encontrar. Todos tenemos toneladas de variantes en nuestros genes, la mayoría de las cuales son muy raras y por su condición de raras, ininterpretables. En resumen, no hay suficientes datos para saber qué estamos viendo (Colleen Caleshu, asesora genética). Si la interpretación de los resultados de un test genético es difícil para el clínico, es aún más difícil para los pacientes (Yvonne Bombard, investigadora en políticas sanitarias).

¿VUS ó no VUS? Clase: 1 2 3 4 5 - MSH6 c.2314C>G; p.Arg772Trp + 2 melanomas 2 pólipos 41a CCR sincrónico dx 33a MSI IHQ pérdida expresión MSH6 35a 40a + - ¿VUS ó no VUS? MSH6: c.2314C>G; p.Arg772Trp 0 1 5 95 99 100 Probabilidad de patogenicidad (%) Clase: 1 2 3 4 5

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AACR-2018 MLH1: 1883 MSH2: 2205 MSH6: 770 PMS2: 410 EPCAM: 28 Total: 5296

Chen R, et al. Nat Biotechnol. 2016;34(5):531-8. Analysis of 589,306 genomes identifies individuals resilient to severe Mendelian childhood diseases. Chen R, et al. Nat Biotechnol. 2016;34(5):531-8. 589.306 genomes 874 genes responsibles for highly penetrant forms of genetic childhood disorders 13 healthy adults harboring mutations for 8 severe Mendelian conditions.

Secuenciación genómica en recién nacidos The National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) and the National Human Genome Research Institute (NHGRI) have committed $25 million over five years to four projects that will investigate the use of genomic sequencing in newborns. 

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Demandas judiciales

José Luis Soto soto_jos@gva.es 966 616 185

Penetrancia del síndrome de Lynch Riesgo acumulado de CCR a los 70 años Escocia Dunlop et al., 1997 74% 30% Finlandia Hampel et al., 2005 69% 52% Inglaterra Barrow et al., 2009 54% 46% Francia Alarcon et al., 2007 47% 33% Francia Bonadona et al., 2011 38% 31% Paises bajos Quehenberger et al., 2005 27% 22% Finlandia Aarnio et al., 1999 82% Canadá Choi et al., 2009 60% 47% Estados Unidos Stoffel et al., 2009 66% 43% Australia Jenkins et al., 2006 45% 38% Hombres Mujeres MLH1 y MSH2 MLH1, MSH2 y MSH6 MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 GeneReviews, 2014 52-82% CCR 51,2% 22,6% España Comunidad Valenciana, 2014 Castillejo A, et al. SEOM 2014

6169 variants (88,3% initially concordant) Clinical laboratories collaborate to resolve differences in variant interpretations submitted to ClinVar. Harrison SM, et al. Genet Med. 2017 Oct;19(10):1096-1104 Four clinical labs collaborated to investigate if data sharing and reassessment resolve interpretation differences. 6169 variants (88,3% initially concordant) 242/274 (87,2%) were resolved by reassessment 12,8% remain discordant due to differences in the application of ACMG criteria [1,5% of total variants remain unsolved] CONCLUSION: Overall concordance was increased from 88.3 to 91.%. Sharing variant interpretation/ identification of differences/motivation to resolve those differences is essential to moving toward more consistent interpretations.

AACR-2018 x 2,3 x 3,2 CRC risk for male PMS2 mutation carriers CRC risk for female PMS2 mutation carriers x 3,2 x 2,3

The BabySeq project: implementing genomic sequencing in newborns. Holm IA, et BabySeq Project Team BMC Pediatr. 2018 Jul 9;18(1):225. n= 240