PCR Y SEGURIDAD ALIMENTARIA 1. Trazabilidad 2. Alimentos transgénicos 3. Detección de fraudes alimenticios 4. Detección de microrganismos en alimentos

1.-TRAZABILIDAD Objetivo : garantizar la seguridad alimentaria y contribuir a que dejen de comercializarse alimentos y piensos que no son seguros. Trazabilidad : supone el uso de marcadores genéticos polimórficos para establecer un sistema de control de origen geográfico y seguimiento de los animales, desde su nacimiento hasta su venta de sus partes en la carnicería.

En el campo de la producción cárnica, se trata de autentificar la población animal que da origen a la carne, permitiendo controlar las denominaciones de origen y marcas de calidad, así como también llevar a cabo el seguimiento de individuos y productos que nos permitirá la identificación del foco original de posibles patologías

Sistemas de identificación en ganado bovino En cuanto a los sistemas de identificación y movimiento de ganado bovino, el Reglamento (CE) 1760/2000 del Consejo y del Parlamento Europeo, que establece un sistema de identificación y registro de los animales de la especie bovina, enumera en su artículo 3 los elementos que han de constituir dicho sistema: - Marcas auriculares, destinadas a identificar individualmente a cada animal - Pasaporte para los animales - Registros individuales llevados en cada explotación - Bases de datos informatizadas

TRAZABILIDAD GENÉTICA Sistema de identificación de animales y productos basado en el ADN contenido en los mismos Instrumento potente para controlar y autentificar los sistemas de identificación tradicionales (crotales, tatuajes, sistemas electrónicos...), puesto que la información genética contenida por un individuo es inalterable durante toda su vida, está presente en cada parte de su organismo y es única en cada sujeto. Sistema con objetividad, repetibilidad y seguridad no alcanzable con ningún otro sistema

Fundamentos de la identificación genética Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. Si tenemos en cuenta que el genoma de cada animal contiene aproximadamente 3x109 pares de bases (pb), las posibilidades que existen de variación entre los distintos individuos son enormes (3x106) ¿Cómo se genera esta gran variación genética? Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual. Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis. Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas. Imposibilidad de la existencia de individuos genéticamente idénticos

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA Toma de muestra: Cualquier muestra de células nucleadas, casi en cualquier estado. Recogida de información de la muestra y establecimiento de una base de datos. BASE DE DATOS sexo explotación procedencia número de identificación individual identificación del padre y de la madre Resultados de genotipos 3. Análisis de diferentes marcadores genéticos en las muestras.

Marcadores genéticos aplicados a la identificación individual Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, y por tanto poder ser usado como sistema de trazabilidad, necesita reunir una serie de características: Que sea muy polimórfico, Que esté distribuido por todo el genoma. Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación Que sea público . Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva. Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN. Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes. Que sea estable

Microsatélites estandarizados a nivel internacional (ISAG) Especie Microsatélite Cromosoma Tamaño Nº alelos Bovina ETH225(D9S1) 9 140-158 8 INRA023(D3S10) 3 196-222 10 ETH104(D5S3) 5 209-223 7 BM2113(D2S26) 2 125-143 BM1824(D1S34) 1 178-190 TGLA227(D18S1) 18 77-97 TGLA126(D20S1) 20 113-125 TGLA122(D21S6) 21 137-183 15 SPS115(D15) 246-260

Especie Microsatélite Cromosoma Tamaño Nº alelos Ovina OARFCB20 2 92-118 12 MAF65 15 121-137 3 INRA063 14 169-207 7 MAF214 16 181-265 6 OARAE129 5 135-165 BM1329 162-174 INRA005 10 120-154 13 SPS113 138-150 4 MCM527 165-179 D5S2 - 190-210 NRA23 1 201-219 8 OARCP49 17 82-138 OARFCB11 122-146 9 CSRD247 215-261 11 HSC 20 269-301 OARFCB304 19 148-190 BM1258 100-128 BM1818 258-270 INRA132 152-172

Especie Microsatélite Cromosoma Tamaño Nº alelos Caprina OARFCB20 2 93-109 12 ILSTS87 6 137-155 8 SRCRSP23 - 85-119 15 INRA063 14 173-179 7 SRCRSP05 21 158-180 SRCRSP08 209-235 SRCRSP24 139-163 9 INRA005 10 118-126 13 MAF65 121-157 3 MCM527 5 152-168 CSRD247 221-247 11 INRA23 197-215 BM1258 23 110-120 BM1329 145-161 BM1818 258-270 I NRA132 152-172

Efecto del número de microsatélites en la probabilidad de que dos muestras coincidan por azar

Porcentaje de individuos incorrectamente identificados en función del número de marcadores utilizados

2.-DETECCIÓN DE OGMs EN MATERIAS PRIMAS MEDIANTE PCR

ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO (Directiva 2001/18/CE) Cualquier organismo, con excepción de los seres humanos, cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento ni en la recombinación natural

CULTIVOS DE GMOs EN EL MUNDO

Evolución de los cultivos transgénicos Fuente: James, 2005 (ISAAA Brief 34)

Evolución por tipo de cultivo

NUMERO DE PAÍSES EN LOS QUE SE CULTIVAN PLANTAS TRANSGÉNICAS 99% de la superficie cultivada con plantas transgénicas corresponde a cuatro países: Estados Unidos (66%), Argentina (23%), Canáda (23%), y China (4%)

PRINCIPALES PAISES PRODUCTORES DE CULTIVOS TRANGÉNICOS MAÍZ SOJA PATATA ALGODÓN

No se ha autorizado ningún organismo transgénico Octubre 1998 hasta Mayo 2003 Moratoria europea No se ha autorizado ningún organismo transgénico

* Maíz 2 variedades tolerantes a herbicidas (Ciba Geigy y AgrEvo) - De los 18 GMOs liberados al medio ambiente 8 son de utilización en la alimentación humana y animal * Maíz 2 variedades tolerantes a herbicidas (Ciba Geigy y AgrEvo) 1 variedad resistente a insectos (Monsanto) 1 variedad tolerante a herbicidas y resistente a insectos (Novartis) * Soja 1 variedad tolerante a herbicidas (Monsanto) * Colza 3 variedades tolerantes a herbicidas (Plant Genetic System y AgrEvo)

ETIQUETADO La UE “reconoce el derecho de los consumidores a la información y el etiquetado como herramienta para una elección responsable” La obligatoriedad del etiquetado se regula en los reglamentos 1829 y 1830 / 2003 del Reglamento Europeo y del Consejo de 22 de Septiembre de 2003 - El etiquetado indicando la presencia de un OMG es obligatorio en todos los casos y sin depender de la cantidad de OMG presente

Creación de plantas transgénicas Genética Creación de plantas transgénicas Detección de transgénicos en una mezcla con una sensibilidad 0,1% Mediante técnica PCR Aplicación a la verificación de etiquetas, seguimiento y detección de fraudes

2.-Autentificación de los componentes de los alimentos Diferenciación de distintas especies Patés y quesos Hamburguesas y productos cárnicos procesados …

Proteícos Métodos analíticos Genéticos

Identificación de fraudes en quesos RAPD: random amplification of polymorphic DNA RAPD-PCR RAPD-PCR

Diferenciación de especies 310 pb 290 pb 750 pb RAPD-PCR Diferenciación de especies 340 pb Caprino Ovino Bovino Sensibilidad de 25 pg

RAPD-PCR Quesos 750 pb 340 pb 310 pb B O C B/O B/C O/C O/B/C

RAPD-PCR Patés 1 3 2

RAPD-PCR RAPD-PCR Patés C/Pt Pt O Pv Pll C Pt

b o cp cv pll pv pt e - PARA DIFERENCIAR ESPECIES BUSCAR REGIONES ESPECÍFICAS DE ESPECIE Pietrain Chato Murciano Landrace Large White Comprobar que se amplifica en todas las razas de cerdo La señal es positiva en cualquier raza de cerdos b o cp cv pll pv pt e - Comprobar que ninguna otra especie animal daba una señal positiva

Amplificación y cuantificación mediante un fragmento específico de especie. 1% 5% 10% 25% 50% 75% 100% Cuantificación por densitometría de la banda

4.-Detección de microrganismos en alimentos Bacterias en alimentos pueden ocasionar grandes pérdidas económicas Deterioran los alimentos Origina enfermedades en consumidores por su dificultad de eliminación VENTAJAS Sensibilidad Especificidad Capacidad de procesamiento de gran número de muestras

DENTRO DEL PRIMER GRUPO (deterioran los alimentos): Detección rápida de bacterias productoras de exopolisacáridos del tipo b-glucano. El uso de este método podría permitir la prevención del ahilamiento de bebidas alcohólicas en el que están implicados estos polisacáridos (especialmente la sidra). Detección gen gtf mediante PCR DENTRO DEL SEGUNDO GRUPO (causan enfermedades)

Microrganismos Trastorno Posible producto Método que ocasiona portador Carne de aves Arroz, prod. Lacteos Y cárnicos Aves, cerdo , res y Leche cruda Pescado, miel, latas Carne de res y aves, Salsas Carne y productos Lácteos Pate, leche, queso, carne Mariscos, ensalada de col Leche, huevo crudo, carne de res y ave Mayonesa, vegetales crudos Leche y aves Ostras crudas, pescado Leche, tofu, canales de cerdo Acrobacter spp Bacillus cereus Campilobacter spp Clostridium botulinum Clostridium perfringens E.Coli Listeria spp Salmonella spp Shigella spp Vibrio cholera Yersinia enterocolitica Diarrea Diarrea, vómitos Botulismo, vómitos Diarrea, dolor abd. Diarrea, colitis Listeriosis Gastroenteritis Fiebre , calambres Cólera Yersiniosis RAPD-PCR PCR PCR múltiple PCR anidado PCR duplex RT- PCR PCR-múltiple RT- PCR RT- PCR PCR simple

EXISTEN KITS COMERCIALES BAX (Qualicom, USA) Salmonella Listeria E.Coli O157:H7 PROBELIA (Sanofi, France) Salmonella Listeria TAQMAN (Perkin Elmer, USA) Salmonella Listeria E.Coli O 157