Espectrometría de Masa Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 8 de mayo de 2014

Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002. Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3

4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

Espectrometría de masa 1- Generalidades

separación y determinación de la relación masa/carga de Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

emisión de energía radiante) Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

Espectrometría de masa de Biomoléculas Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos  Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material

Espectrometría de masa de Proteínas Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional

Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

z siempre es un integral positivo Masa (definiciones) Se determina m/z q = ±ze , e = 1.6022 x 10-19 coulomb z siempre es un integral positivo

Masa Todas las moléculas tienen una composición química única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones) C 6 12.011 12 C 13 C 14 C 6 6 6

Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 12.0000 98.90 13C 13.0034 1.10 14N 14.0031 99.634 15N 15.0001 0.366 16O 15.9949 99.762 17O 16.9991 0.038 18O 17.9992 0.200 31P 30.9738 100.00 32S 31.9721 95.02 33S 32.9715 0.75 34S 33.9679 4.21 36S 35.9671 0.02 79Br 78.9183 50.69 81Br 80.9163 49.31 Carlos Cerveñansky

Masa La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1% Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes

Masa Ejemplo: 12C (98.9%) y 13C (1.1%) En Buckminsterfullereno (C60) La probabilidad que todos los átomos sean 12C: P = (0.989)60 = 0.515

Masa

Masa

Masa: definiciones Masa molecular se mide en unidades de masa atómica unificadas (u) u = m(12C) /12 = 1.6605402 × 10-27 kg (u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora -2009- arcaico) Peso atómico: promedio por composición isotópica → Peso molecular Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero Masa más abundante Masa promedio

Masa: definiciones Carlos Cerveñansky

Masa: definiciones

Determinación del número de cargas (z) 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 524.3 525.3 526.2 Una sola carga: Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu m/z

Determinación del número de cargas (z) 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 262.6 263.1 263.6 Dos cargas: Delta = 0.5 amu Delta = 0.5 amu Delta = 0.5 amu m/z

Espectrometría de masa de proteínas 37 kDa 37136 amu

Los Iones son importantes Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M+H]+ o [M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

M(péptido) = 1162 Da Espectrometría de masa Modo positivo Modo negativo m = +1 +23 +39 -1

Espectrómetro de masa Espectrometría de masa Muestra TOF MALDI Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Orbitrap Sector Magnético MALDI ESI Alto Vacío

¿Cómo volatilizar una proteína? Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

Espectrómetros de masa Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS: ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance Orbitrap: ESI-orbitrap

Espectrometría de masa 2- MALDI-TOF

Ionización por MALDI: Espectrometría de masa (Matrix assisted Laser desorption/ionization) (Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:

Ionización por MALDI: Espectrometría de masa La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

Espectrometría de masa MALDI-TOF Matriz: acidos aromaticos

Espectrometría de masa 4HCCA DHBA SA

t  (m/z)1/2 MALDI-TOF Espectrometría de masa Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

MALDI-TOF Ek = zeEs E + - Espectrometría de masa + + D s Detector Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. E + - + + s D Detector Fuente

MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Fig. Separación por TOF + + + + Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Ek = zeEs = ½mv2  v = (2zeEs/m)½ E + - Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente

MALDI-TOF v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2 Espectrometría de masa MALDI-TOF Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma Ek, v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Fig. Separación por TOF + + + + + - Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky

Espectrometría de masa Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t Carlos Cerveñansky

MALDI-TOF Espectrometría de masa Generalmente se observa la especie monocargada (M+H)+

MALDI-TOF Espectrometría de masa Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM

MALDI-TOF Espectrometría de masa Se pueden estudiar masas en un amplio rango

Resolución en MALDI-TOF Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) 1672.92 Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Carlos Cerveñansky

Espectrometría de masa 3- ESI-MS

ESI Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization N2 Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray) N2

ESI Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization N2 Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador N2

ESI-Q Espectrometría de masa Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas

ESI-Q Espectrometría de masa Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

Espectrometría de masa Trampa de iones Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”.

ESI-MS Espectrometría de masa La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones m/z = (M+n)/n Donde n es el número de protones (masa = 1.0078 u, ~ 1)

ESI y carga [M+2H]2 + Substance P [M+H] + 674.7 1347.7 685.7 600.4 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 Da/e 100 % 674.7 666.1 600.4 462.8 685.7 693.6 1347.7 [M+2H]2 + [M+H] +

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro 10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro 10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1)  n = (x2-1)/(x1-x2) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo

ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM Alto PM

Espectrometría de masa ESI-MS Resolución de varias especies

Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ion Pocas, en general 1 Muchas Rango de m/z 50000 3000 Rango de masas 200.000 70.000 Interacciones no covalentes No Si MS/MS limitado, PSD Si, CID Acoplar LC Tolerancia a contaminantes

Conclusión Espectrometría de masa Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas

Continuará…

Seroalbúmina humana +45 +44 +47 +46 +49 +48 +51 +50 +52 +54 +53 +56 +55 Lucía Turell

Seroalbúmina humana Lucía Turell