Caracterización del transcriptoma de parásitos helmintos Cecilia Fernández

Estudios genómicos en parásitos Biología básica Identificación/desarrollo de productos control (drogas, vacunas) diagnóstico (Ag)  Objetivos  Dificultades Los parásitos no son organismos ‘modelos’ Las especies relevantes son diversas Desarrollos tecnológicos: secuenciación, (bio)informática Análisis del genoma Protozoarios Análisis del transcriptoma Helmintos Estrategias “clásicas”

Clonas genómicas vs clonas de ADNc Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24) • contienen UTRs 5’ y 3’ • incluyen información de ARNnc (que no codifican para proteínas) • no contienen intrones • frecuencia nivel de transcripción Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

Estudios genómicos en parásitos helmintos Los helmintos son organismos que causan infecciones crónicas, con alta prevalencia en todo el mundo  Importancia  Dificultades  Poseen genomas grandes (108 pb/102 Mb)  Las especies relevantes son diversas Proyectos EST: Secuenciación sistemática de ADNc seleccionados al azar de genotecas de diferentes estadios • Nematodos ~ 550,000 ESTs (excl.C. el.) • Trematodos • Algunos cestodos Datos dbEST (NCBI), 11/09  Estrategia ~ 450,000 ESTs

Ensamblaje (‘clustering’) y análisis de ESTs ‘Genoma parcial’ del organismo Figure 1: Overview of the EST analysis process Taking primary sequence reads through to an analysed dataset requires but a few steps that can be automated to handle thousands of sequences at a time. Figure 2: Clustering using CLOBB The process used by CLOBB to cluster ESTs relies on the use of custom-built BLAST databases. Each sequence is taken in turn and compared to all those previously examined. If a significant match is found, the cluster identifier of the matched sequence is attributed to the new one. If the new sequence is apparently novel, it is ascribed the next available cluster identifier. The CLOBB software is able to deal with more complex issues that can arise, such as a single new sequence matching more than one previous cluster (implying that clusters should be joined). Tomado de Parkinson y Blaxter (2004) Methods in Mol Biol 270: 93-126 Ensamblaje (‘clustering’) y análisis de ESTs

Tomado de Balavoine G. ‘Evolution and development of protostomes’ Protostomados Deuterostomados Lofotrocozoarios Ecdisozoarios Anelids Tomado de Balavoine G. ‘Evolution and development of protostomes’ Los helmintos… Nematodos y Platelmintos (Cestodos y Trematodos) integran grupos distintos de metazoarios

Estudios genómicos en “helmintos” de vida libre (organismos modelos) Genomas de: ● Nematodo Caenorhabditis elegans (1997) - http://www.wormbase.org (Caenorhabditis spp. 4 especies adicionales) ● Platelminto - Turbelario Schmidtea mediterranea (2008) - http://smedgd.neuro.utah.edu

Estudios genómicos en parásitos helmintos Genomas de: ● Nematodos Brugia malayi y Meloidogyne spp. - 1a versión terminada y publicada (2007 y 2008) ● Platelmintos Trematodos Schistosoma mansoni y S. japonicum - 1a versión terminada y publicada (2009) Cestodos Echinococcus multilocularis y Taenia solium - en proceso de ensamblaje

Tomado de Brindley et al. PLoS NTD, 2009 Estudios genómicos en parásitos helmintos Draft completed Tomado de Brindley et al. PLoS NTD, 2009

Ver también Martin et al (2009) NAR Estudios genómicos en nematodos http://www.nematode.net Ver también Martin et al (2009) NAR

NEMBASE: base de datos de ESTs de Nematodos http://www.nematodes.org Screenshots from a typical search strategy on NEMBASE. [1] Annotation search page: on this page users may either retrieve a cluster by entering its ID or the ID of one of its constituent sequences (a) or select a species and enter some text to search for keywords in the BLAST annotation associated with clusters from that species (b). Output may be viewed in terms of relative abundance, BLAST score or using the SimiTri Java tool (c). [2] SimiTri output page: selecting the SimiTri output option creates the embedded Java applet (d); individual clusters are represented by coloured tiles on the graphic. The relative position of the tiles indicates the clusters' relative similarity to the three selected data sets. Clusters with similarity to only one or no data set are listed below the applet (e). Clicking on a tile whilst holding the control key held down, or selecting a cluster from the list below the applet launches the detailed cluster page [3]. This provides information on the number and source of the constituent sequences, summaries of BLAST annotation and further links to e.g. raw trace chromatograms [4] associated with the sequences. Tomado de: Parkinson et al (2004) NAR 32: D427-D430

Tomado de: Mitreva et al. Trends in Genetics 21(10): 573-81, 2005 Genómica y/o transcriptómica de nematodos Filogenia (ARNr 18S) especies con proyecto EST (‘genoma parcial’) y/o proyecto genoma (*) Genome information across the phylum Nematoda. All species with either significant numbers of ESTs in public databases (>100) or genome projects are arranged phylogenetically based on small subunit (18S ribosomal RNA) (SSU) rRNA phylogeny. Species with genome projects completed or underway are indicated by asterisks. Tomado de: Mitreva et al. Trends in Genetics 21(10): 573-81, 2005

Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004 Secuencias predichas de “genomas parciales” vs proteoma de C. elegans EST data sets from across the phylum Nematoda. Species are grouped into major taxonomic groups based on SSU rRNA phylogeny. This differs from ‘traditional’ phylogenies but is consistent with current morphological and developmental evidence. The trophic biology of each targeted species is indicated by a small icon. (b) The proportion of each species’ partial genome that has significant similarity (a match with a raw BLASTX score >50) to the complete proteome of C. elegans. Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004

‘Espacio génico’ del phylum Nematodos Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004 C. elegans C. elegans: 20,000 genes (12,000 flías) 22,000 polipéptidos Otros: 30 especies (28 parásitos) ~ 93,000 “genes” (60,000 flías) (> 250,000 ESTs) Gene discovery in nematode EST data sets. Exploration of genespace in the phylum Nematoda. The cumulative number of different genes (those that have no significant similarity to any other gene) in the EST and proteome data sets from the phylum Nematoda. Each point represents the addition of one nematode species. The first point represents the approx. 22,000 C. elegans proteins. As each partial genome data set was added, increasing the total number of genes (x axis), the number of different genes (y axis) increased. There was no apparent fall-off in the rate of discovery of new genes, suggesting that nematode genespace may be very large. The colors indicate the systematic origin of each species group. • 50% sin homólogos fuera del phylum Nematodos • 15% en todos los grupos de nematodos: la mayoría (90%) con homólogos fuera del phylum ~ 1,300 específicos de nematodos

Aunque poseen un plano corporal uniforme… • los nematodos son extraordinariamente diversos • el genoma de C. elegans representa una porción pequeña del espacio génico del phylum

Algunos genes identificados a partir de ESTs • poseen ortólogos fuera del phylum • no están presentes en el genoma de C. elegans • genes perdidos en la evolución del linaje de C. elegans • genes asociados con el parasitismo (?)

El complejo de genes Hox en la evolución de los nematodos Hox Genes in Nematodes The isolated Hox genes are indicated by boxes that are colored by orthology group. Horizontal lines indicate linkage, and crosses indicate Hox genes that are missing from the C. elegans genome and 7x coverage of the C. briggsae genome and the absence of a central gene between B. malayi ant-1 and egl-5. Colored vertical lines through boxes indicate confident orthology assignment based on characteristic residue and phylogenetic analyses. Curly brackets indicate possible lineage-specific gene duplications. The tree on the left summarizes the robust SSU rDNA phylogeny for the nematodes. Circles colored by orthology groups on the tree are positioned to indicate the earliest possible time of Hox gene loss from the C. elegans lineage based on the data presented here. Tomado de: Aboobaker y Blaxter, Current Biology 13: 37-40, 2003

Genes asociados con el parasitismo: ‘factores de virulencia’ adquiridos por transferencia horizontal Meloidogyne spp. (parásitos de las raíces de plantas) habrían adquirido 12 genes de bacterias del suelo por transferencia horizontal (HGT) Incongruencia entre las filogenias del gen y de la especie Varios genes habrían sido “donados” por rizobios (bacterias fijadoras de nitrógeno en nódulos en raíces de leguminosas) con los que estos nematodos comparten . el nicho . los mecanismos de interacción con la planta Phylogram of NodL-like proteins from plant parasitic nematodes and bacteria. NodL-like proteins were identified in Meloidogyne species using BLAST searches and aligned to a set of homologs from prokaryotes (color-coded according to function on the phylogram). This unrooted tree was generated by neighbor-joining using protein distance measures, with percent support from 1000 nonparametric bootstrap replicates indicated. The scale bar represents 0.1 amino acid replacements per site. NodL: N-acetil transferasa que participa en la síntesis del factor Nod, glicolípido involucrado en el intercambio de señales entre la bacteria y la planta Tomado de: Mitreva et al. TIG 21(10): 573-81, 2005

Tomado de: Wang y col. BMC Genomics 211:307, 2010 Caracterización del transcriptoma de Ancylostoma caninum Tomado de: Wang y col. BMC Genomics 211:307, 2010 La comparación revela que: • el transcriptoma de los nematodos es diverso (tanto A. caninum como C. elegans integran el Clado V) • existirían genes “relacionados con el parasitismo” (A. caninum (Clado V) y B. malayi (Clado III) integran clados distintos) Over 1.5 million ESTs were generated from 4 stages, infective L3 larva (iL3), activated L3 larva (ssL3), adult male (M), and female (F), of A. caninum. Assembly, which was performed to reduce data redundancy and improve sequence quality and length, grouped the sequences into 48,326 transcripts longer than 90 bp, for a total of 23 Mb. Using the core eukaryotic genes as a reference, we estimated that 93% of the A. caninum transcriptome is identified, making this the first parasite nematode with a near complete sequenced transcriptome. C. elegans and B. malayi coding genes were downloaded. The A. caninum transcripts were compared against these coding genes to identify homologs and matches. By this way, A. caninum transcripts could be classified in 4 groups: those sharing homology with both C.elegans and B. malayi genes, those sharing homology with only C. elegans genes or only B. malayi genes, and those sharing no homology with any other species. We defined the first group as nematode conserved, the last group as A. caninum specific, and those sharing homology only with B. malayi genes as parasitism related. Even though A. caninum and C. elegans fall in the same phylogenetic Clade (Clade V)[12], only about 20% of A. caninum transcripts are homologous to C. elegans coding genes, and even lower number (14%) to B. malayi coding genes (Figure 1A). When all the transcripts were considered, the vast majority (77%) of the A. caninum transcripts were species-specific. This indicates high transcriptome diversity among nematodes. There were 1,643 transcripts with B. malayi homologs (1,365 genes) but no C. elegans homologs (Figure 1A) despite A. caninum being more closely related phylogenetically to C. elegans. Meanwhile, homology comparison among the free-living C. elegans and the parasites A. caninum and B. malayi found that more B. malayi genes share homology with A. caninum (5,991) than with C. elegans (5,532) (Figure 1B). The higher number of homologous genes among parasites was statistically significant (P < 1.0e-4, Chi-square test). Since B. malayi (Clade III) is phylogentically more distant from A. caninum than C. elegans (both are in Clade V), B. malayi would share a similar level of homology with both C. elegans and A. caninum if parasitism had no effect on gene evolution. Therefore, we hypothesize that the 1,643 transcripts represent putative parasitism related genes. Venn diagram showing distribution of BLAST matches. Amino acid level homologies with bitscore of 50 or better were considered. A. caninum transcripts homologous to B. malayi and C. elegans. Only 23% of the transcripts (11,025/48,326) shared homology, leaving 37,301 transcripts to be specific to A. caninum. B. malayi genes homologous to A. caninum and C. elegans. About 62% of the 11,609 B. malayi genes shared homology. Higher number of B. malayi genes had homologs to the parasitic A. caninum compared to the free-living C. elegans, and 4,406 B. malayi genes did not share homology.

Análisis del transcriptoma de trematodos S. mansoni S. japonicum

El transcriptoma de S. mansoni Número de secuencias Total de secuencias 163,586 Total de secuencias analizadas Adultos Huevos Miracidios B. Germinales Cercarias Esquistosómulas (7 días) 33,180 19,077 18,638 16,715 10,014 27,016 124,640 Tamaño promedio de ESTs (pb) 385 Total de SmAEs SmAEs con más de una EST (‘contigs’) SmAEs con una EST (‘singlets’) 12,322 18,666 30,988 Tamaño promedio de un contig (pb) 505 SmAEs de secuencias conocidas de S. mansoni Genes conocidos (GenBank) ESTs conocidas (dbEST) 639 (2%) 6,447 (21%) 7086 (23%) SmAEs de genes nuevos de S. mansoni Similares a proteínas de S. mansoni (nuevos parálogos) Similares a genes de otros organismos (nuevos ortólogos) Sin similitud con otros genes (función desconocida) 449 (1%) 6,274 (20%) 17,179 (55%) 23,902 (77%) Total de genes (estimado) 13,960-14,200 Tomado de: Verjovski-Almeida et al . 2003

S. mansoni EST Genome Project http://bioinfo.iq.usp.br/schisto/ S. mansoni EST Genome Project Assembled S. mansoni EST sequences

‘Otras estrategias’ / Desarrollos futuros Genotecas enriquecidas en ADNc completos Genotecas enriquecidas en tipos particulares de ADNc • normalizadas y sustraídas enriquecidas en genes poco expresados [hasta 50% - 15,000 – 20,000 ARNm de célula somática típica] • de expresión diferencial enriquecidas en genes expresados diferencialmente Una célula somática típica expresa unos 10,000 a 20,000 genes, y la abundancia de los transcriptos varía de unas 200,000 copias a 1 o menos por célula. En términos generales, puede considerarse que: 10-20 genes (abundantes) expresan varios miles de copias de ARNm por célula – lo que representa aproximadamente el 20% de la masa de ARNm varios cientos de genes (abundancia mediana) expresan varios cientos de copias de ARNm por célula - aprox el 40-60% de la masa total de ARNm varios miles de genes (poco abundantes) expresan < 50 copias de ARNm por célula – aprox 20-40% de la masa total de ARNm Por tanto, la secuenciación al azar no permite identificar eficientemente ARNm de genes con baja expresión. Análisis del transcriptoma sin clonar (RNA Seq)

Desafíos de la era ‘post-genómica’... • interpretar el genoma (ADN) y el transcriptoma (ADNc derivados de genes expresados en distintos estadios) junto con estudios de las proteínas expresadas (proteoma) y vías metabólicas (metaboloma) de los organismos • comparar estos procesos fisiológicos con los de los hospederos para contribuir al desarrollo de nuevas estrategias de control de las parasitosis

Bibliografía • Brindley et al (2009) Helminth genomics: the implications for human health. PLoS NTD 3(10):e538 Una revisión actualizada a 2009 de los proyectos genoma y transcriptoma de helmintos patógenos del hombre. • Parkinson et al (2004) A transcriptomic analysis of the phylum Nematoda. Nat Genet 36(12):1259 Una estudio global del transcriptoma de 30 especies de nematodos, incluyendo 28 parásitos. • Mitreva et al (2005) Comparative genomics of nematodes. Trends in genetics 21(10): 573 Otra revisión que enfatiza la idea de diversidad molecular del Phylum; incluye las evidencias de adquisición de genes de bacterias fijadoras de nitrógeno por transferencia horizontal por parte de los nematodos de plantas. • Wang et al (2010) Characterizing Ancylostoma caninum transcriptome and nematode diversity. BMC Genomics 11:307 Caracterización muy completa del transcriptoma de un helminto, utilizando tanto estrategias de generación de ESTs “clásicas” como con las nuevas herramientas de secuenciación. • Verjovski-Almeida et al (2003) Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet 35(2):148 • Hu et al (2003) Evolutionary and biomedical implications of a Schistosoma japonicum complementary DNA resource. Nat Genet 35(2):139 Artículos que describen análisis exhaustivos del transcriptoma de dos especies de Schistosoma, ambas patógenas del hombre. • Parkinson & Blaxter (2004) Expressed sequence tags: analysis and annotation. Methods Mol Biol 270: 93 Capítulo de un volumen de protocolos experimentales que describe una plataforma de herramientas para el análisis de ESTs.