Fundamentos de Espectrofotometría 4ª y última parte abril 2006 Por: M. en C. de Educ. Guadalupe E. Daleth Guedea Fernández abril 2006

Distribución de la luz en el espectrofotómetro Curva Patrón Tipos de Espectrofotómetro Referencias e Imágenes

Distribución de la luz en el espectrofotómetro

Espectrofotómetro Mecanismo Interno   Espectrofotómetro Mecanismo Interno

Rojo (R) 700 nm Verde (G) 546.1 nm Azul (B)   Met.Cient. I COLOR LONGITUD DE ONDA (l) Rojo (R) 700 nm Verde (G) 546.1 nm Azul (B) 435.8 nm  

Es usual que al seguir una “receta” para la determinación de la concentración de un compuesto en particular se indica una longitud de onda (l) específica a la que hay que leer con el colorímetro o espectrofotómetro. ¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes? La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción característico Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su concentración La relación entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada y su concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración mayor proporción de luz absorbida. l Absorbancia l Absorbancia Absorbancia Conc.

Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol.. Espectro de Absorción (línea continua) y Espectro de Transmisión (línea discontinua).

La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática celda de 5uL La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática

Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente muestra un comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda, es usual que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este material .

Curva Patrón El argumento para el proceso de determinación de una concentración desconocida es: A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en figura siguiente)

Absorbancia del problema R B A N C I Absorbancia del problema Interpolación

A1 = Absorbancia del problema. Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración: A1 / A2 = C1 / C2 Donde: A1 = Absorbancia del problema. A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida. C1 = Concentración del problema. C2 = Concentración del estándar. Si despejamos C1 = Conc del problema A1 (problema) * Conc estándar Conc. (problema) = A2 (estándar)

Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro) TUBO Stock de Safranina (3 x10 -4 g/ml) ml Agua Destilada ml 1 10 2 0.05 9.95 3 0.10 9.9 4 0.20 9.8 5 0.40 9.6 6 0.80 9.2

En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero Compuesto 1 (blanco) 2 3 4 5 6 7 Glucosa 0,1 mg/ml (mL) 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Agua destilada (mL) 0.9 Fenol al 5% (mL) Acido sulfúrico (mL) 5.0

RESULTADO de la curva patrón anterior Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm Tubos Absorbancia 1 2 0.135 3 0.253 4 0.417 5 0.658 6 0.574 7 0.768

Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales intervalos Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH), l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a absorciones intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos compuestos que absorben en la región ultravioleta:

Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la región del infrarojo

Tipos de Espectrofotómetro Existen en la actualidad diversos tipos de aparatos con los mismos principios los hay mecánicos y digitales; unos miden solo la luz visible, otros son más precisos y miden también luz U.V. , Infrarroja, de absorción atómica (AA), flurescencia de rayos-X de emisión de plasma (ICP),, multipropósitos (para medir directamente la solución con suspensión, muestras sólidas y biológicas), acoplado a masas,etc..

Diferentes tipos de espectrofotómetros MCI MCI Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V. MCI Para medir Luz Visible y U.V. Diferentes tipos de espectrofotómetros

Spectronic 20 D Spectrónic 20

Partes del Spectronic 20 D

Manejo de espectrofotómetro En las siguientes diapositivas se les proporciona el instructivo para el manejo el espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.

Manejo de espectrofotómetro Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se activará la luz roja de encendido (b). Seleccionar la longitud de onda con el botón (c). Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y sin muestra. Insertar la cubeta con el blanco en su sección (d). b d c a

Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia) Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa. La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia f d e

CUIDADOS Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados. El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla. La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad

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Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Guedea Fdz * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Guedea Fdz. Guadalupe., “ Fundamentos de colorimetría y espectrometría” Julio de 2005, para Met. Científica 1 Biología , FES Iztacala UNAM. Sin publicar ***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea casanchi@ya.com Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas en el 2005 de los aparatos que se encuentran en el Laboratorio de Metodología Científica I de la Carrera de Biología en la Facultad de Estudios Superiores Iztacaca UNAM México.

DATOS DEL AUTOR Mexicana, Bióloga (UNAM) y Maestra en Ciencias de la Educación (ETAC); Correo: daleth_guede@yahoo.com.mx , dalethguedea@hotmail.com y/o daleth.guedea@gmail.com