microRNAs Silvia Juliana Serrano Gómez BSc, MSc Coordinadora FICMAC-Lab

Dogma central de la biología molecular Transcripción y traducción ARN: Acido Ribonucleico Tipos de ARN mARN: Mensajero Ribosomal RNA (rARN) tranferenciaRNA (tARN)

ADN Vs. ARN ACIDOS NUCLEICOS: Grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada.

Factores de transcripción Transcipcion genica ADN molde Región de transcripción - Promotor Factores de transcripción ARN Polimerasa

Generación de mARN

Splicing del mRNA Generación de mARN

Traducción del ARN

Que es un microRNA? Familia de pequeños ARNs (Small RNAs) Secuencias de cadena sencilla no codificantes de ARN de aproximadamente 22 nucleotidos (nt) que regulan la expresión génica. Pasos para la generación de un microRNA 1. Gen codificante de microRNA  Transcrito de 70nt 2. Pre-miRNA forma estructura de tallo-orquilla (Stem-loop) 3. Pre-miRNA es procedaso por DICER en un miRNA de 21 – 25nt

microRNAs Como regulan la expresión génica? miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target  degradación del mRNA: RNAi INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL 2. Unión imperfecta del miRNA al mRNA INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION)

Como regular la expresión génica Biogénesis de los microRNAs Precursor largo RNAse III 70 nt RNAi Regulación génica RNAse III

Unión parcial por el 3’UTR del mRNA

microRNAs Características Existen alrededor de 300 en el genoma (1-3% genes expresados) UNA DE LAS MAS GRANDES CLASES DE GENES REGULADORES Regulan diferentes procesos celulares Ciclo celular, diferenciación, desarrollo, metabolismo y enfermedades humanas (diabetes, desordenes inmunológicos, neurodegenerativos y cáncer) Aproximadamente el 50% se encuentran en sitios fragiles Regiones de amplificación: Asociados con cáncer Ubicación en el genoma Regiones intragenicas 50% en unidades de transcripción como intrones o exones de transcritos codificantes y no codificantes

Alteración en la expresión de los miRNAs Perdida de su función

Alteraciones a nivel de transcripción Durante el procesamiento del miRNA Annu Rev Pathol. 2009 ; 4: 199–227

Supresores tumorales y oncogenes NO-Bloquea transcripción de oncogén Bloquear transcripción de supresor tumoral

Generalidades microRNAs en cáncer Secuencias corta de RNA (~22-5pb) Actúan a través que un complejo supresor (RISC) Degradación del mRNA blanco Represión de la traducción Un daño en le procesamiento del miRNA se puede traducir en predisposición a cáncer

microRNAs en gliomas

miRNAs y expresion en gliomas miR-21 Determinación de niveles de miR-21 Grado II: gliomas de bajo grado, grado III: astrocitoma anaplasico y oligodendrogliomas, grado IV: glioblastomas Los niveles de miR-21 permanecen bajos en gliomas de bajos grados y es significativamente mayor en glioblastomas qRT-PCR Northern blot miR-21: Involucrado en estos procesos claves Proliferación microvascular: Reorganización de la matriz extracelular y capacidad de proliferación

Rutas moleculares afectadas por miR-21 Ensayos usando anti-miR-21 bajos en gliomas de bajos grados y es significativamente mayor en glioblastomas miR-21:oncogen Promueve: proliferacion, anti-apoptosis e invasión

Blancos miR21 Apoptosis Proliferación Invasión Migración 3 Blancos miR21 Apoptosis Proliferación Invasión Migración 2 4 1

Efecto ANTI-APOPTOTICO En Apoptosis Ruta de p53 Ruta de TGFβ Citoquina inhibidora del crecimiento Estabilizar p53 miR-21 Debilita la respuesta de p53 a estímulos como daños en el ADN Efecto ANTI-APOPTOTICO

Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP) MMP: Peptidasas – degradación matriz extracelular Niveles aumentados en gliomas

Efectos sobre la proliferación Ruta mediada por PDC4 Efectos sobre la proliferación

miR-21 TGFβ p63 JNY TOPORS TP53BP2 HNRPX DAXX miR-21 p53 DAXX Transcripción genes JNK APOPTOSIS APOPTOSIS

Invasión y angiogénesis TIMP3 MMP RECK miR-21 Invasión y angiogénesis miR-21 PDC4 p21 p53 Arresto de ciclo celular

mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)

Señalización a través de factores de crecimiento en GMBs Células de glioblastoma U251 (PTEN mutado) LN229 (PTEN Silvestre) Phosphates and tensin homolog (PTEN) located on chromosome ten, which encodes a cytoplasmic enzyme with both protein and lipid phosphates activity, is mutated, decreased or not expressed at chromosome 10q23 in 20~40% of malignant glioblastomas [2]. Loss of function PTEN leads to Akt activation by PI3K phosphorylation and results in poor prognosis of GBM [3,4]. Downstream activated Akt is associated with the RTKs (receptor tyrosine kinases), which include EGFR, IGFR, and VEGFR. These activated components of RTK pathways could further promote cell survival and anti-apoptotic reactions through phosphorylation and inactivation of downstream factors [5-7]. Thus, PTEN is a key checkpoint in the Akt signaling pathway and its dysfunction triggers RTKsdependent oncogenesis. Perdida de PTEN: Peor Pronostico

Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Regulacion de miR-21 por su inhibidor (2’-OMe-) antisense oligonucleotides were reported to knockdown miR-21 expression in human glioblastoma cells [14]. Regulation of miR-21 by the inhibitor was verified by RT-PCR, as shown in Fig.1. Transfection of the miR-21 inhibitor altered mir-21 levels relative to the control by 9.4-fold and 8.5-fold in U251 and LN229 glioblastoma cells, respectively.

Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad del taxol shows that the taxol concentration causing 50% growth inhibition (IC50) of U251 cells is 400 nmol/mL; whereas, in combination with the miR-21 inhibitor (20 μmol/L) the IC50 was 60 nmol/mL. Taxol can also increase the efficacy of the miR-21 inhibitor Inhibición en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentración taxol-inhibidor

Células de glioblastoma Perdida de PTEN: Peor Pronostico Acción sobre AKT Células de glioblastoma U251 (PTEN mutado) LN229 (PTEN Silvestre) Phosphates and tensin homolog (PTEN) located on chromosome ten, which encodes a cytoplasmic enzyme with both protein and lipid phosphates activity, is mutated, decreased or not expressed at chromosome 10q23 in 20~40% of malignant glioblastomas [2]. Loss of function PTEN leads to Akt activation by PI3K phosphorylation and results in poor prognosis of GBM [3,4]. Downstream activated Akt is associated with the RTKs (receptor tyrosine kinases), which include EGFR, IGFR, and VEGFR. These activated components of RTK pathways could further promote cell survival and anti-apoptotic reactions through phosphorylation and inactivation of downstream factors [5-7]. Thus, PTEN is a key checkpoint in the Akt signaling pathway and its dysfunction triggers RTKsdependent oncogenesis. Perdida de PTEN: Peor Pronostico

Actividad de AKT: Contribuye a supervivencia Ensayos Western-Blot Taxol Taxol Taxol + Anti-miR-21 Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21 Anti-miR-21 Activation of the AKT pathway in malignant cells contributes to survival signaling [15]. We first examined the levels of phosphor-AKT expression in LN229 and U251 cells after treatment with the miR-21 inhibitor combination with taxol therapy (Fig. 3). The protein level determined by western blotting demonstrated that treatment of both LN229 and U251 cells with miR-21 inhibitor and taxol combination therapy could dramatically reduced the expression of phosphorylated Akt (p-Akt) significantly (P < 0.01) compared with either single taxol chemo-therapy or miR-21 inhibitor therapy alone. Reducción de la expresión de p-AKT usando combinación del inhibidor y quimioterapia

Aumento de muerte celular por apotosis – Efecto aditivo miRNAs y apoptosis 24,68% 21,97% 18,74% 21,75% 6,24% 6,24% Compared with single taxol (6.24% and 6.25%, respectively) and miR-21 inhibitor (21.75% and 18.74%, respectively) treatment in U251 and LN229 cells, the combination of the miR-21 inhibitor and taxol therapy caused a significant (p < 0.05) increase amount (24.68% and 21.97%, respectively) of apoptotic death, suggesting that an additive induction of apoptosis developed in the cells co-infected with the miR-21 inhibitor and taxol. Aumento de muerte celular por apotosis – Efecto aditivo

miR-21 y resistencia temozolamida

Ensayos de viabilidad celular In this study, results showed cell viability of U87MG cells was significantly decreased by the clinically used methylating agent 100 μM TMZ. However, a treatment with miR-21 overexpression before TMZ prevented the decrease of cell viability induced by 100 μMTMZ (Fig. 2B). Tratamiento con miR-21 hace células resistentes a tratamiento con TMZ

miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis Ensayo de apoptosis TMZ: Induce apoptosis miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis All treatment groups were examined under the fluorescence microscopy and cells were counted to determine the percentage of apoptotic cells (Fig. 2D). Morphological observation showed that TMZ could significantly induced apoptosis in U87MG cells compared with control (P<0.05), however, as shown in Fig. 2C, upregulating the level of miR-21 expression could partly decreased the percentage of apoptotic cells induced by TMZ

Cascadas de señalización Bax/Bcl2 Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis Aumento relación Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminución de la relación Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias DisBax: promotor de apoptosis Bcl2: inhibidor de apoptosis The decrease in Bax/Bcl-2 ratio is thought to contribute to the resistance of glioma cells to anticancer therapy by modulating the apoptotic cascade Expresión relativa del radio Bax/Bcl2 Medición niveles Bax y Bcl2 por western blot

miR-7 y proliferación Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR Baja regulación de miR-7 en glioblastoma

miR-7 miR-7 miR-7 AKT PROLIFERACION EGFR miR-7 PI3K IRS1 miR-7 IRS2 miR-7 AKT PROLIFERACION

PROLIFERACION CELULAR Vía del EGFR-AKT PROLIFERACION CELULAR

EGFR y AKT juegan un papel central en los Glioblastomas EGFR andAkt play central roles in glioblastoma. We noted that, in addition to targeting EGFR, miR-7 also includes among its predicted targets upstream regulators of the Akt pathway, such as IRS-1 andIR S-2. The effect of miR-7 transfection on Akt activity was determined by immunoblot for Akt phosphorylatedat Ser473

Decrecimiento en la expresión de EGFR y de AKT Inmunoblot de EGFR Decrecimiento en la expresión de EGFR y de AKT Inmunoblot de AKT: fosforilación en Ser173

IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7

EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibición de AKT por miR-7 es dependiente de la inhibición de EGFR? La inhibicion de AKT por miR-7 es dependiente o independiente del estado de EGFR? Es independiente, miR-7 suprime la activación de AKT independientemente de la inhibición del EGFR

Conclusiones (1) Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que regulan a expresión de diferentes genes Dos mecanismos de regulación: iRNA microRNA La gran mayoría de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frágiles asociados con cáncer Daños en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de cáncer.

Conclusiones (2) mirR21 es un oncogén sobre-expresado en glioblastomas y se encuentra asociado con resistencia a agentes quimioterapéuticos  Apoptosis microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresión de EGFR y AKT  Proliferación celular Representan un blanco terapéutico  Uso de antagonistas