Alta Frequencia de infección por VHC Oculto en pacientes en HD con Anti-VHC y VHC-RNA Negativos en suero Guillermina Barril, Inmaculada Castillo , Dolores Arenas**, Elena Rodriguez-Inigo*, Mario Espinosa***, Juan Garcia Valdecasas****, E. Glez Parra + , Carmen Sanchez ++ ,Rafael Selgas++, Vicente Carreño*. Servicios de Nefrología: Hospital U. de la Princesa, Madrid; H. Perpetuo Socorro**, Alicante; H. Reina Sofia***, Cordoba; H. U. San Cecilio****, Granada, H. Central de la Defensa ,Madrid, Hospital La Paz ++ Madrid y Fundación para el Estudio de Hepatitis Virales* ,Madrid

SITUACIÓN ACTUAL INFECCIÓN OCULTA POR VIRUS C Artículo original: J Infect Dis 2004 (Castillo y cols.) Editoriales: Artículos relacionados J Infect Dis 2004 (Hollinger B) J Infect Dis 2004 (Stapleton et al) Curr Gastroenterol Rep 2004 (Coyle J) J Virol 2004 (Pham et al) Hepatology 2005 (Liang T) Intern Med 2004 (Esaki et al) Gastroenterology 2005 (Blendis L) J Clin Virol 2004 (Carreño et al) Am J Gastroenterol 2005 (Gordon SC) Hepatology 2005 (Radkowski et al) Lancet 2005 (Quiroga et al) J Infect Dis 2005 (Radkowski et al) Gut 2005 (Castillo et al) J Infect Dis 2005 (Lee et al)

Objetivo Estudiar la existencia de infección oculta por VHC en pacientes en hemodiálisis mediante la determinación del VHC-RNA en sus CMSP

CRITERIOS DE INCLUSIÓN: * Niveles altos de ALT (> 28 UI/l) y/o gamma-GT * Marcadores serológicos negativos de infección por VHB (AgHBs negativo) y VHC (anti-VHC y VHC-RNA negativos) * Exclusión de otras causas de daño hepático

MATERIAL Y MÉTODOS I: Estudio multicéntrico en el que han participado 6 unidades de hemodiálisis en la inclusión de pacientes: * Hospital Univ. de la Princesa - Madrid * Hospital Perpetuo Socorro – Alicante * Hospital Reina Sofía - Córdoba * Hospital Univ. San Cecilio - Granada * Hospital Central de la Defensa – Madrid * Hospital La Paz – Madrid Los datos fueron enviados al HUP y procesados en base de datos SPSS 11.0 , se utilizó T de student para comparación de medias en variables continuas con distribución normal y la U de Mann withney para las no paramétricas- La determinación de la infección oculta por VCH en CMSP se realizó por la FEHV

MATERIAL Y MÉTODOS II: Controles sanos = 10 Número de pacientes incluidos = 42 Controles sanos = 10 * Aislamiento CMSP para detección VHC-RNA 1) RT-PCR con cebadores región 5’ NC 2) Hibridación in situ con sonda región core * Recogida de datos clínicos y analíticos

CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES Edad (años) 61,7 ±14,0 Sexo (Masculino/Femenino) 26/16 Tiempo en hemodiálisis (meses) 80,41 ±174 Tiempo de enzimas hepáticas alteradas (meses) 23,73 ± 27,64 ALT (UI/l, el día toma de muestra 32,28 ± 21,76 GGT (UI/l, el día toma de muestra) 126,47 ± 100,49 ALT (UI/l, los 6 meses anteriores) 24,97 ± 13,42 GGT (UI/l, los 6 meses anteriores) 94,86 ± 83,48

RESULTADOS 26/42 (61,9%) de los pacientes por RT-PCR * Se detectó infección oculta por VHC en las CMSP de 26/42 (61,9%) de los pacientes por RT-PCR * Todos los casos (positivos y negativos) se confirmaron por hibridación in situ * Las CMSP de los controles sanos fueron siempre VHC-RNA negativo por RT-PCR e hibridación in situ

COMPARATIVA CARACTERÍSTICAS DE PACIENTES VCH-RNA + VCH-RNA - p (N=26) (N=16) Sexo (% Masculino) 61,9 38,1 0,69 *Edad (años) 57,9 ± 13,3 67,9 ± 13,2 0,02 Tiempo hemodiálisis (meses) 103,26 ± 215,6 40,8 ± 28,8 0,2 Tiempo enzimas hepáticas alteradas (meses) 26,8 ± 22,04 18,6 ± 28,7 0,3 **ALT (UI/l, día toma muestra) 36,0 ± 19,5 26,2 ± 24,3 0,02 GGT (UI/l, día toma muestra) 143,3 ± 117,9 99,1 ± 56,0 0,3 * T de student, ** U de Mann-Withney

Niveles transaminasas durante los 6 meses previos a la inclusión en el estudio ALT GGT p<0,000 p< 0,22 Test U de Mann-withney

NIVELES DE ENZIMAS HEPATICAS Entre los pacientes con infección oculta por VCH * 4/26 (15,3%) ALT elevada * 8/26 (30,7%) GGT elevada * 14/26 (53,8%) ALT y GGT elevadas

CONCLUSIONES INICIALES En la población estudiada, el 61,9% de los pacientes en hemodiálisis con niveles alterados de ALT y/o GGT de etiología desconocida y negativos para los marcadores serológicos de los virus de hepatitis (incluyendo el VCH-RNA en suero), presentan una infección oculta por VCH en sus CMSP, por lo que pueden ser potencialmente infecciosos

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS Estudiar la replicación del VCH oculto en las CMSP de los pacientes en hemodiálisis * Detección de la cadena antigenómica (intermediario replicativo) del VCH

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS Problemas de especificidad en la detección de la cadena antigenómica del VCH por RT-PCR 1) Alta complementaridad interna de bases en la región 5’ NC del VCH 2) Cadena genómica 10-100 veces más abundante que cadena antigenómica Falsos positivos

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS Cadena genómica C G UUUCCG -----CGGCUGA Cadena antigenómica AAAGGC-----GCCGACU CGGCTGA cDNA AAAGGC-----GCCGACU CGGCTGA . UUUCCG -----CGGCUGA GCC C T G A 42º 60º AAAGGC-----GCCGACU CGGCTGA . UUUCCG -----CGGCUGA GCC C T G A PCR PCR ¿Verdadero positivo? Sólo verdaderos positivos

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS Detección cadena genómica Cadena genómica (fg RNA) 0.1 1 10 100 M N (pg RNA) 1 10 100 M N Cadena antigenómica Detección cadena antigenómica Cadena antigenómica Cadena genómica (fg RNA) (pg RNA) N 0.1 1 10 100 M N 1 10 100 M

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS Detección simultánea de la cadena genómica y antigenómica por hibridación in situ Cadena genómica Región 5’NC Región core ACGCCGUUUAGG----------UAGGGAACACGGU----- . . . . . . . . . . . . UGCGGCAAAUCC Cadena antigenómica Región 5’NC Región core UGCGGCAAAUCC----------AUCCCUUGUGCCA----- . . . . . . . . . . . . . UAGGGAACACGGU

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS Detección simultánea de cadena genómica y antigenómica

INFECCIÓN OCULTA POR EL VIRUS C DE LA HEPATITIS EN PACIENTES EN HEMODIÁLISIS * En 15 /26 (57,9%) pacientes en hemodiálisis con infección oculta por VCH se detecta la cadena antigenómica del virus por RT-PCR y por hibridación in situ El VCH está replicando en las CMSP de estos pacientes

Caso clínico con biopsia hepática Paciente de 53 años con ERC por GN IgA, Inicia HD en 1990 hasta 1992 …..Tx renal Recibe injerto renal de donante cadaver en ese año En Marzo 2003 reingresa en HD por NCI En Abril de 2004 presenta GPT 56 UI/l, GGT 340 UI/l por primera vez con marcadores serológicos negativos para VHC

INFECCIÓN OCULTA POR VCH EN PACIENTE EN HEMODIÁLISIS (anti-VCH y VCH-RNA negativo) Antecedentes ALT GGTP Abril 2004 56 340 Mayo 2004 44 355 Julio 2004 42 275 Octubre 2004 50 268 Febrero 2005 Cadena genómica VCH: Positivo Muestra de CMSP Cadena antigenómica VCH: Positivo Se indica determinación de VHC oculto en CMSP por presentar elevación de ALT y GGT más de 9 meses con marcadores virológicos en suero negativos.

INFECCIÓN OCULTA POR VCH EN PACIENTE EN HEMODIÁLISIS (anti-VCH y VCH-RNA negativo) Marzo 2005 muestra de biopsia hepática RT-PCR H. in situ Cadena genómica VCH 260.000 copias Positivo (3%) Cadena antigenómica VCH 62.000 copias Positivo (1%) Diagnóstico histológico: Colestasis (persistía en tto con Ciclosporina y prednisona)

Conclusión Final Por todo ello actualmente, cuando pacientes en HD presentan elevaciones de ALT ( GPT) y/o GGT de forma ondulante o persistente, de etiología desconocida, y con marcadores virales serológicos negativos (incluyendo RNA-VHC), una infección oculta por VHC debe ser considerada.