DIPLOMADO EN CITOLOGÍA VETERINARIA MÓDULO I TÉCNICAS DE COLORACIONES CITOLÓGICAS

INTRODUCCIÓN Una tinción o coloración es una técnica auxiliar en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina, para resaltar estructuras en tejidos biológicos, que posteriormente serán observados en los diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden se utilizados para aumentar la definición, resaltando por ejemplo los núcleos de los citoplasmas, o diferentes poblaciones de células sanguíneas polimorfonucleares y Neutrófilos, permiten también resaltar organelas especificas de células individuales o incluso en los tejidos diferenciando fibras musculares o tejido conectivo.

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SU TIPO OBTENCIÓN DE MUESTRAS COLORANTES NATURALES Hematoxilina Carmín Safranina Orceina Básicos: tiñen estructuras ácidas AZUL DE METILENO Ácidos: tiñen estructuras básicas EOSINA Neutros: el ácido y la base son componentes activos EOSINATO AZUL DE METILENO Metacromáticos: colorantes básico que reaccionan de manera diferente a diversas estructuras Indiferentes: estos no posee aspectos ácidos, básicos o salino y colorean mediante impregnación Colorantes Nucleares Colorantes Citoplasmáticos COLORANTES ARTIFICIALES Eosina Giemsa Rojo Congo

SEGÚN TIÑAN Específicas: colorea solo un elemento o un grupo de elementos de un tejido. directas (simple inmersión del colorante) indirectas (no puede obrar directamente) Sustancias oxidantes mordientes Mordiente + colorante = LACA

Simples (un solo colorante) Combinadas (varios Colorantes) DE ACUERDO A LA MANERA DE REALIZAR LA COLORACIÓN: Progresivas (aumentan la intensidad de la coloración a medida que aumenta el tiempo de exposición al colorante) Regresivas (sobrecolorean el preparado, decolorándolo para conseguir contraste adecuado). SEGÚN SE UTILICEN UNO O VARIOS COLORANTES: Simples (un solo colorante) Combinadas (varios Colorantes)

Normocromáticas (mismo color) En coloraciones SIMPLES según tomen o no el mismo color del colorante pueden ser: Normocromáticas (mismo color) Metacromáticas (viran hacia un tono distinto). Granulaciones de leucocitos. COLORACIONES PANOPTICAS (poner en evidencia el mayor numero de elementos con mayor variedad de tonos) colorantes anfocrommos - metacromasia COLORACIONES VITALES colorantes vitales no tóxicos muy diluídos LUGOL, EOSINA, AZUL DE METILENO (ideal para protozoarios).

GLOSARIO DE TÉRMINOS RELACIONADOS CON LAS TINCIONES Definición Mordiente Reactivo que aumenta la reactividad del tejido estableciendo una interacción tejido colorante Alumbre Modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y confiriéndole un carácter muy básico Coloración indirecta en un tiempo Aquella en la que el tratamiento del tejido con el colorante y el mordiente se realiza simultáneamente en una misma solución Coloración indirecta en dos tiempos Cuando colorante y mordiente actúan separadamente Término Definición Tinción progresiva Tinciones en las que los colorantes y mordientes se aplican siguiendo una secuencia definida y bajo estricto control de los tiempos para lograr una intensidad determinada. Tinción regresiva Primero se sobre colorea y posteriormente se elimina el exceso de colorante por diferenciación Diferenciación Consiste en eliminar el exceso de colorante mediante agentes diferenciadores (disoluciones alcohólicas de ácidos o álcalis, etanol, acetona, etc.)

PROTOCOLOS DE COLORACIÓN

TINCIONES HEMATOLÓGICAS TINCIÓN DE WRIGHT Diferencia bien la morfología de los linfocitos, tiñendo el núcleo de púrpura y citoplasma levemente azulado. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azur B, colorante básico. La eosina Y, colorante ácido, se fija a las proteínas básicas.

Los núcleos de los linfocitos grandes aparecen de color púrpura. Linfocitos B (productores de inmunoglobulinas) y células inmaduras, presentan un citoplasma de color azul intenso, debido a su gran producción de ARN. La solución May Grünwald tiñe las estructuras acidófilas. La solución Giemsa, tiñe el citoplasma de los linfocitos y la cromatina de los núcleos. TINCIÓN MAY GRÜNWALD-GIEMSA

COLORACION DE GIEMSA Células linfocitos - Aumento de 30X Fijar el frotis con alcohol metílico 3 Min Giemsa y tampón PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). Solución Salina Amortiguada por Fosfatos Lavar el portaobjetos con agua destilada. Dejar secar. Aplicar el cubreobjetos sobre la preparación

COLORACION DE DIFF- QUICK Células linfocitos - Aumento de 20X Fijador: Solución de fijación Contiene verde sólido en metanol. 15 Seg. Solución I: Contiene Eosina y ácido de sodio como conservante 1 a 2 Minutos Solución II : Contiene tinción de Tiazina una de las variantes que se presenta es el Azul de Metileno. 1 a 2 Minutos

GRAM Fijar la muestra con metanol 3 Min al calor COLORACION DE GRAM Células Superficiales e Intermedias - Aumento de 10X Fijar la muestra con metanol 3 Min al calor Agregar azul violeta 1 Min Enjuagar con agua corriente Agregar lugol y esperar 1 Min. Agregar alcohol acetona 5 y 30 Seg. Enjuagar con agua. Tinción de contraste safranina o fucsina  Básica 1 Min. luego lavar levemente con agua

COLORACIONES CITOLÓGICAS

PAPANICOLAU COLORACION DE PAPANICOLAU Células superficiales e intermedias - aumento de 50X 1. Alcohol etílico 96º 15 Seg. 2. Alcohol etílico 70º 15 Seg. 3. Alcohol etílico 50º 15 Seg. 4. Agua Destilada 15 Seg. 5. Hematoxilina de Harris 6 Min. 6. Agua destilada 10 inmersiones. 7. Sol ácido clorhídrico 0,5% 1 - 2 inmersiones rápidas. 8. Agua destilada 15 Seg. 9. Sol Amoníaco 1,5% en 70º La extensión vira al azul. 10. Alcohol etílico 50º 15 Seg. 11. Alcohol etílico 70º 15 Seg. 12. Alcohol etílico 96º 15 Seg. 13. O G 6 (orange) 2 Min. 14. Alcohol etílico 96º 10 inmersiones. 15. Alcohol etílico 96º 10 inmersiones. 16. EA 50 (36) Eosina amarillenta) 3 Min. (Usar EA 65 para orinas y esputos) 17. Alcohol etílico 96º (10 inmersiones) 18. Alcohol etílico 100º (10 inmersiones) 19. Xilol (10 inmersiones) 20. Montaje

COLORACION DE PAP - MART Células superficiales e intermedias LSIL - aumento de 20X Alcohol al 100 diluido en Agua destilada 3 Min. Agua Destilada Hematoxilina Harris de 2 a 6 Min. Agua Corriente 6 a 12 Min. Alcohol etílico al 70º 30 Seg. Alcohol etílico al 80º 30 Seg Alcohol etílico al 90º 30 Seg Pap – Mart de 2 a 6 Min. Alcohol etílico 100º 30 Seg. Alcohol etílico 96º 35 Seg. Alcohol Xileno 20 Seg. Xileno 30 Seg. Xileno de 2 a 4 Min. Montaje

HEMATOXILINA – EOSINA para procedimiento Citológico COLORACION DE H - E Corte Histológicos de Cartílago elástico - Aumento de 14X HEMATOXILINA – EOSINA para procedimiento Citológico Alcohol al 100 diluido en Agua destilada 3 Min. Agua Destilada Hematoxilina Harris de 2 a 6 Min. Agua Corriente 15 Seg. Alcohol etílico al 70º 30 Seg. Alcohol etílico al 80º 30 Seg Alcohol etílico al 90º 30 Seg Eosina de 2 a 6 Min. Alcohol etílico 100º 30 Seg. Alcohol etílico 96º 35 Seg. Alcohol Xileno 20 Seg. Xileno 30 Seg. Xileno de 2 a 4 Min. Montaje

SE LES RECOMIENDA VISITAR LOS SIGUENTES ENLACES TINCIÓN DE WRIGHT https://www.youtube.com/watch?v=yFDCFvrWodM TINCIÓN MAY GRÜNWALD-GIEMSA https://www.youtube.com/watch?v=GHBqhSXT-6I TINCIÓN DE GIEMSA https://www.youtube.com/watch?v=9LHK3TKNeJk TINCIÓN DE DIFF QUIK https://www.youtube.com/watch?v=VZmWvCWBU2E TINCIÓN DE GRAM https://www.youtube.com/watch?v=FceD8FFhuew COLORACIÓN DE PAPANICOLAOU https://www.youtube.com/watch?v=A4P3KvXwlec https://www.youtube.com/watch?v=u4iA8VVjTu4 https://www.youtube.com/watch?v=aXpZG2YHXPg COLORACIÓN DE PAP – MART https://www.youtube.com/watch?v=r9BqCU2ZyYQ COLORACIÓN DE HEMATOXILINA – EOSINA https://www.youtube.com/watch?v=NPOqiPyaxo0 https://www.youtube.com/watch?v=F7dW7VJEm2I