Síntesis de DNA: (NMP)n+1 + PPi (NMP)n + NTP Adición de nucleotidos a un extremo 3’ OH en crecimiento. Síntesis 5’-3’. DNA polimerasa Requisito: RNA partidor Secuencia generada es complementaria a la de la hebra templado Pi pirofosfatasa Pi 30 de Marzo 2010

1° etapa: Iniciación. La replicación se inicia en el ORIGEN DE REPLICACION 3 2 30 de Marzo 2010

2° Etapa: elongación. Extensión de la horquilla de replicación One strand has to be synthesised in sections (Okazaki fragments, 100-1000 pb) 30 de Marzo 2010

DnaA binds to one of the 9 bp DnaA boxes that has a high affinity for binding. This promotes cooperative binding of DnaA-ATP to the 6 bp sites nearby thereby positioning DnaA throughout the region of unwinding. Since DnaA-ATP has a 10 x higher affinity for ssDNA than for dsDNA, this region becomes unwound in what is effectively the rate-limiting step in assembly. As the region unwinds, the ssDNA is stabilised by DnaA-ATP. ATP is slowly hydrolyzed by DnaA and the process of recycling and recharging DnaA with ATP is an important parameter in controlling the rate of replication in E. coli. Approximately 30 molecules of the DnaA protein form a complex that binds to the region of the origin containing the 9 bp repeats. This region wraps around the DnaA complex. This reaction is facilitated by the HU protein and by IHF, two proteins that help to structure DNA in bacteria. The DnaA complex progressively melts the three 13 bp repeats to form a 45 bp "open complex". ATP is also required for this step. A complex formed by DnaB and DnaC binds to the melted region to form a "prepriming complex". DnaC is released. In the presence of SSB (Single-strand binding protein) and Dna Gyrase, DnaB unwinds the DNA further. [24-11] 30 de Marzo 2010

3° Etapa: Terminación Maduración por eliminación de los fragmentos de Okazaki DNA polimerasa con actividad 5´-3´exonucleasa DNA ligasa DNA ligasa une los fragmentos de Okazaki 30 de Marzo 2010

Actividad autocorrectora (proofreading o editing) de DNA polimerasa Exonucleasa 3`-5`corta los nc. erróneos 30 de Marzo 2010

DNA polymerases of E. coli I II III Molecules/cell 400 100 10 Elongation rate (bases s-1 ) 20 5 1000 3’ – 5’ exonuclease + + + 5’ – 3’ exonuclease + - - Processivity 200 10,000 500,000 DNA pol III síntesis del DNA en replicación DNA pol II reparación de DNA DNA pol I reemplaza partidores de RNA por actividad 5’ 3’ exonucleasa) durante la replicación. También en reparación. 30 de Marzo 2010

30 de Marzo 2010

Comparación procariontes-eucariontes Forma del cromosoma circular lineal N° de cromosomas Uno o dos Muchos (en pares homólogos) Origenes de replicación Uno por cromosoma Múltiples Replicación bidireccional ? Si Velocidad de duplicación? 1000 nucleotidos/segundo Telómeros ? No Si 30 de Marzo 2010

30 de Marzo 2010

DNA polimerasas de eucariontes ENZIMA FUNCIÓN ADN Pol α Síntesis del partidor: Inicia la síntesis de Hebra retrasada y de hebra líder. 10 bases de ARN y 25 de ADN. No act. proofreading ADN Pol δ Principal. Síntesis de la las dos hebras despues de primasa. Act profreading, muy procesiva ADN Pol ε Función no muy conocida. Puede polimerizar las piezas de Okazaki reemplazando a la Pol δ. Act proofreading ADN Pol β Implicada en reparación ADN Pol γ Síntesis ADN mitocondrial. 30 de Marzo 2010

El problema de replicar cromosomas lineales 30 de Marzo 2010

30 de Marzo 2010

30 de Marzo 2010

Replicación de genomas de bacteriófagos 30 de Marzo 2010