EFECTO CITOTÓXICO DE CEPAS DE BACILLUS MEGATERIUM AISLADAS DE MIEL SOBRE CÉLULAS EPITELIALES HUMANAS DE LA LÍNEA CACO -2 López, Ana C.1; Minnaard, Jessica1; Pérez, Pablo F. 1.3 y Alippi, Adriana M.2 Laboratorio de Referencia de Loque Americana de la OIE. Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, calle 60 y 119, 1900, La Plata, Buenos Aires, Argentina. E-mail: alippi@biol.unlp.edu.ar 1 Investigadores CCT La Plata - CONICET; 2 Investigadora CIC (Prov. Bs. As., Argentina) 3Cátedra de Microbiología-Facultad de Ciencias Exactas – UNLP. Esta investigación fue subsidiada por la ANPCyT y CIC (ARGENTINA). INTRODUCCION La calidad de la miel está influenciada por la presencia de microorganismos, particularmente bacterias esporuladas y levaduras. Un estudio realizado sobre mieles argentinas reveló la presencia de Bacillus megaterium, entre otras especies esporuladas aeróbicas. B. megaterium no está asociado con intoxicaciones alimentarias a pesar de encontrarse en miel cepas con factores de virulencia presentes en especies patógenas humanas. Tampoco existen estudios sobre interacción bacteria-células eucarióticas. ABSTRACT Bacillus megaterium isolates from honey: Cytotoxic effects on the human intestinal epithelial cell line Caco-2. Honey quality is influenced by microorganisms, particularly yeasts and spore-forming bacteria. As Bacillus megaterium is commonly found in Argentinian honeys, the aim of this study was to evaluate the interaction of B. megaterium with Caco-2 cells monolayers. Epithelial cells were grown in DMEM plus 15 % fetal calf serum (37 °C, 15 days, 5 % CO2 – 95 % air atmosphere). Bacterial strains were incubated in Luria Bertani (LB) broth (32°C for 3 h) under agitation. After centrifugation, pellets were suspended in DMEM plus 100 µg/ml cloramphenicol and cell density standardized. Infection assays were incubated for 2 h at 37 °C in a 5% CO2 – 95 % air atmosphere. The invasion was assessed by the aminoglycosid protection assay. Quantitative association and invasion were evaluated by plate counting in nutritive agar. Results showed that 6 strains tested adhered to and invaded monolayers. Adhesion values were similar for all the strains but two strains showed the highest invasion values. Epithelial cells were detached after infection when no cloramphenicol was used, suggesting that protein synthesis is involved in biological activity. This is the first report on the direct interaction between B. megaterium and Caco-2 cells. OBJETIVO Evaluar la interacción entre cepas de Bacillus megaterium aisladas de miel y enterocitos humanos en cultivo. MATERIALES Y MÉTODOS Asociación 1 ml de agua destilada a 37C /1 hora Cultivos de B. megaterium de 3 hs de incubación a 32C en agitación se resuspendieron en DMEM + cloranfenicol (100 µg/ml) Concentración final: 108 ufc/ml Las monocapas celulares de Caco-2 lavadas con PBS se incubaron con las suspensiones bacterianas (37C durante 2 hs en 5% de CO2/95 % de aire). Luego se determinó asociación e invasión. Monocapas celulares de la línea Caco-2 cultivadas 15 días en medio DMEM Invasión 1°) 1 ml de gentamicina (100 µg/ml): 1hs a 37°C. 2°) Tres lavados con PBS. 3°) 1 ml de agua destilada 37C/1 hora. Se utilizaron diluciones seriadas de las muestras y recuentos en placas de agar nutritivo para cuantificar la asociación e invasión. RESULTADOS Las cepas de B. megaterium evaluadas presentaron diferentes capacidades de asociar (Figura 1) e invadir (Figura 2) a las células Caco-2. Figura 1: Asociación de las cepas de B. megaterium a células Caco-2 (2 hs a 37°C en 5% de CO2/95 % de aire) CONCLUSIÓN Este trabajo es el primer estudio de interacción directa entre células vegetativas de Bacillus megaterium y enterocitos humanos en cultivo. Figura 2: Invasión de cepas de B. megaterium a las células Caco-2 (ensayo de protección con gentamicina)