LA TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS    Pregunta 1: ¿ Cómo se inicia y termina la transcripción?       RNA polimerasa Factores de iniciación y terminación   Pregunta 2: ¿ Dónde se inicia y termina la transcripción?   Secuencias consenso

Conceptos Básicos de la transcripción ·       Hebra codificante y molde  ·      Unidad de transcripción  ·       Transcrito primario  ·       Las Proteínas reguladoras controlan que genes van a ser transcritos y cuando

Algunos conceptos de la transcripción: Promotor Punto de Inicio Curso arriba Curso abajo Terminador

Un único tipo de RNA polimerasa LA RNA POLIMERASA Un único tipo de RNA polimerasa ·  Holoenzima de 465 kD: a2bb’s ·  Núcleo de la enzima: a2bb’ (capacidad de sintetizar RNA)  bb’ el centro catalítico ·  a ensamblaje de la enzima Reconocimiento del promotor Interacción proteínas reguladoras ·   s reconocimiento del promotores  Escasa información de la topología de la enzima: 90 x 95 x 100 Å ·  Canal en superficie 25 Å (vía DNA)

Generalidades de la RNA Polimerasa Síntesis 5’ 3’ 40 nt/s @ 37oC Controla la entrada de nt: minimiza errores Desenrolla DNA al frente Enrolla DNA en la espalda

Generalidades de la RNA Polimerasa Se mueve como los “gusanos”   Compresión ·       Expansión

Las etapas de la Transcripción de DNA Inicio: Formación burbuja de transcripción Elongación: Incorporación de nt Terminación: Frenar a la Polimerasa

¿Cómo sabe RNA pol donde iniciar síntesis?: El FACTOR s Unicamente la holoenzima puede iniciar la transcripción · El factor s asegura unión del núcleo enzimatico al promotor · Variedad factores: activados por cambios ambientales ·  Formas del complejo Holoenzima: 75-80 pb (-55 a +20) ·   Liberación factor: 60 pb (-55 a –35) ·   Extensión RNA: 15-20 pb (30-40 nt)

INICIO DE LA TRANSCRIPCION    Complejo binario cerrado: interacción holoenzima-promotor Desnaturalización DNA: complejo binario abierto      Se incrementa la afinidad de la unión      Incorporación del primer nt: pppG o pppA      Formación del complejo ternario      Existen ciclos abortivos de la iniciación: punto crítico de 9 pb      Si se supera la síntesis de 9 nt, la iniciación es un éxito y se produce la elongación    Frecuencia de la iniciación: 1 iniciación/s

¿Cómo dirige factor s a RNA pol? ·   Núcleo enzima tiene afinidad por unirse a DNA “loose binding” ·   Factor s: dirige holoenzima específicamente hacia los promotores, previene “loose binding” Reconocimiento de sitios de unión específicos

¿Cómo encuentra la RNA Pol el promotor? Tres modelos para encontrar los promotores: ·       Difusión: demasiado lento ·       Unión e intercambio de sitios hasta encontrar promotor ·       Deslizamiento sobre DNA (no hay pruebas)

Cómo está definido el punto de inicio de la transcripción? Anatomía de un Promotor

¿Cómo desvelar el sitio de unión de la RNA Polimerasa?

Preferencia de la RNA Polimerasa por la hebra copia

Interacción del factor s con el Promotor

……Y donde y como se termina la transcripción

MODOS DE TERMINACION  ·      Secuencias de terminación ·       Detiene elongación y libera RNA ·       Controla expresión génica ·       Secuencias de terminación muestran poca similaridad ·       Tipos: ·       Terminadores Intrinsecos Terminación dependiente de Rho (o ro) ·       Rho es un factor esencial en E. Coli

Terminadores Intrínsecos ·   Ricos en G-C ·   Formación horquilla estructura secundaria ·   6 residuos U al 3’ ·   interacción rU-dA muy débil

Terminación Dependiente de la Proteína Rho Aunque hay pocos terminadores dependientes de rho ·       Riqueza en residuos C y pobre en G Rho es una proteína de 46 kD, quizas forme un hexámero ·      Tiene actividad ATPasa que depende de RNA y/o presencia de poli-ribonucleótidos de > 50 nt

¿Cómo termina rho la elongación? ·   Modelo de la “persecución caliente” ·       Rho se une a la cadena de RNA ·       Se desliza a lo largo del RNA ·       La síntesis se detiene en la secuencia de terminación ·       Rho alcanza la polimerasa (gracias a la pausa) ·       5’-3’ actividad helicasa con hidrólisis de ATP: separación del híbrido RNA-DNA ·       La traducción puede interferir con la actividad de rho: esos ribosomas ·       Mutaciones en rho: fallos en la terminación

OTRAS PROTEINAS REGULADORAS DE LA TERMINACION El loci nus en E. Coli: NusA ·  Factor de transcripción general ·  Aumenta terminación ·  Tendencia de RNA pol a deternerse ·  Se une al núcleo de RNA pol a2bb’s Iniciación ·   a2bbNusA Terminación

Anti-terminación de la transcripción   ·       Mecanismo de control     Circuitos reguladores de fagos ·       Operones bacterianos      Factor de antiterminación regula positivamente expresión génica ·       Las proteínas pN y pQ del fago l

La Anti-terminación del fago I

La elongación del RNA